研究背景在微生物、植物及哺乳动物等生物体中,生物节律都是普遍存在的现象。对于人类的健康,保持自身节律的稳定更是尤为重要。在不断加快节奏的社会生活状况下,以及由于工作或其他原因而出现的倒班或时差等都会造成生物节律的紊乱,并导致人体在基因表达、蛋白合成、能量代谢等过程中发生异常,进而诱发肿瘤、心血管疾病、睡眠障碍甚至更严重的精神疾病,给社会及家庭带来巨大的经济和精神负担。因此,为了提高人们的健康水平和改善人们的生活品质,节律产生与调控的机制研究迫在眉睫。下丘脑视交叉上核(SCN)是哺乳动物生物节律的掌控中心,它是控制哺乳动物日常生理和行为与外界24 h明/暗周期保持昼夜节律同步的振荡器。解剖学上通常将SCN分成至少两个区域,包括腹外侧的核心区和背侧壳区。研究发现,在核心区,有大量的神经元分泌血管活性肠肽(VIP)和γ-氨基丁酸(GABA);在背侧壳区,有大量表达血管加压素(AVP)的神经元;Buijs等用免疫共染的方式观察到在大鼠SCN区VIP神经元末梢和AVP神经元末梢均分泌GABA。数十年来,研究者们用大量的实验来研究这些神经肽在生物节律系统中的作用。其中,运用VIP基因敲除的小鼠模型,Colwell和他的同事们在VIP基因缺陷的小鼠上观测到,在持续的黑暗条件下,小鼠的活动比在明/暗循环时相位前移8 h,而且它们自由活动的周期变短。Colwell等还发现VIP能增强野生型和VIP基因缺陷小鼠SCN神经元抑制性突触信号的传递。他们从生理、行为上证实了,VIP在调节生物时钟的功能上有重要的作用。同时,Evans等指出SCN中VIP信号与GABA信号共同调节SCN昼夜节律的同步化。有意思的是,SCN上的大部分神经元都是GABA能的,而且几乎所有SCN神经元都能产生自发的抑制性突触后电流(IPSC),这说明GABA受体存在于几乎所有的SCN神经元上。而Takahashi等指出VIP神经元投射和接收其他神经元的GABA能输出分布非常稀疏。VIP神经元抑制性突触传递是否真的如Takahashi观察到的那样稀疏,有待验证。我们提出假设,这一结果可能与Takahashi等实验中所取的SCN脑片是冠状面方向有关,矢状面与冠状面脑切片上VIP神经元所保留的抑制性突触属性是否相同,GABA能分布是否真的那么稀疏,有待研究。另一方面,SCN中最重要的信号是来源于自感光视网膜神经节细胞(ip RGCs),光信号被其接收并通过视网膜下丘通路(RHT)传递,ip RGCs的突触末梢同时释放谷氨酸(Glutamate)和腺苷酸环化酶激活肽(PACAP),主要作用于SCN的VIP神经元,那么VIP神经元的兴奋性属性又如何,有待研究。此外,在PACAP-/-小鼠上,光诱导的生物节律系统相位延迟和前移的节律均减弱。而PACAP在RHT通路将光信号传递至SCN并调节生物节律过程中发挥作用的机制尚不清楚。基于上述情况,本研究拟通过离体脑片电生理膜片钳记录、光遗传等生物技术手段,研究SCN上的VIP神经元兴奋型和抑制性突触的属性以及SCN中的神经肽类对生物节律的影响。目的在能够标记分泌VIP神经元的基因小鼠模型上,将不同时间获得含有SCN区的新鲜脑片,通过电生理膜片钳全细胞实验记录VIP和非VIP神经元在白天和夜晚不同时间动作电位的发放;在矢状面或冠状面方向制作SCN脑片记录VIP和非VIP神经元IPSC、微小抑制性突触后电流(m IPSC)的变化;冠状面SCN脑切片记录VIP和非VIP神经元神经元接收的兴奋性突触后电流(EPSC)、微小兴奋性突触后电流(m EPSC)。此外,为了研究ip RGCs通过RHT投射到SCN的末梢所释放的PACAP对SCN昼夜节律的影响,本实验利用转基因手段将光敏感离子通道表达在ip RGCs细胞膜上,通过光遗传方法激活ip RGCs轴突末端,运用电生理膜片钳全细胞实验研究PACAP拮抗剂对SCN区神经元接收的视网膜投射产生的突触后电流的影响。方法1.离体脑片的制备10-12周龄的转基因小鼠用异氟烷麻醉后,快速且温和地取出整脑(其中夜间的实验在近红光下进行,以避免动物接收到外界光的影响),置于4?C NMDG切片液中,用振动切片机切取300μm厚度矢状面或冠状面含有SCN区的脑切片,再移入装有人工脑脊液(ACSF)的容器中,于37?C水浴孵育45 min。全程通含有95%O2和5%CO2的混合气,孵育结束后再转到室温(约25?C)下进行电生理记录。2.全细胞膜片钳电生理记录采用全细胞电压钳和电流钳记录的方式记录VIP和非VIP神经元的动作电位发放、IPSC、m IPSC、EPSC和m EPSC;全细胞电压钳记录SCN区神经元被470 nm波长蓝光激发ip RGCs末梢产生的突触后电流。3.RT-PCR将孵育结束后10-12周龄OPN4-Td T小鼠的SCN新鲜脑片,在显微镜下,用玻璃电极分离出SCN组织,提取脑组织中的全部RNA,用RT-PCR检测PAC1,VPAC1,VPAC2和NPY在SCN的表达情况。4.微循环给药系统全细胞电压钳记录SCN区神经元被470 nm波长蓝光激发ip RGCs末梢产生的突触后电流一段时间后,微循环给予终浓度为500 n M的PACAP受体拮抗剂PACAP6-38,再给予470 nm波长的光刺激,记录PACAP6-38对ip RGCs投射到SCN上的影响。5.统计学方法所有电生理数据运用Clampfit10.6,Igor6.0和Graph Pad Prism 5进行处理和统计分析,实验结果以?x±SEM表示,组间平均值用t检验进行比较,p<0.05具有统计学意义。结果1.动作电位的发放:VIP神经元动作电位的发放频率在白天和夜间均显著高于非VIP神经。2.IPSC:冠状面脑片VIP神经元白天和夜间IPSC的频率均低于非VIP神经元,且其自身夜间IPSC的频率显著高于白天。矢状面脑片非VIP神经元白天IPSC的频率显著高于VIP神经元。相较于冠状面脑片,矢状面脑片两类神经元自身白天IPSC的幅值均显著升高,其中VIP神经元自身的IPSC的频率也显著升高。3.m IPSC:冠状面上,VIP神经元白天m IPSC的幅值和频率均高于其夜间;非VIP神经元白天m IPSC的幅值高于夜间;两类神经元白天m IPSC的频率有显著性差异。矢状面脑片同类神经元之间以及两类神经元之间白天和夜间m IPSC无显著性差异。这两种脑片同类神经元之间和两类神经元之间白天和夜间m IPSC无显著性差异。4.EPSC:同类神经元之间和两类神经元之间在白天和夜间的EPSC均无显著性差异。5.m EPSC:VIP神经元白天和夜间m EPSC的频率和幅值均无显著性差异。6.ip RGCs在夜间对SCN的投射强度显著高于白天。7.PACAP拮抗剂能显著抑制ip RGCs白天对SCN的投射强度。结论1.VIP神经元在白天和夜间动作电位显著高于非VIP神经元,可能是VIP神经元调节昼夜节律的重要原因。2.VIP神经元在矢状面和冠状面上突触连接的特性具有显著性差异,显示由于抑制性突触的投射方向导致在两个切面上记录不同的结果。3.VIP神经元夜间m IPSC频率的减少,表明VIP神经元突触前的作用可能是由光信号通路介导调控的,但是究竟是光引起的VIP神经元突触前囊泡包装数量发生变化还是引起突触后受体数量发生变化,尚不清楚。4.PACAP受体拮抗剂能明显抑制ip RGCs对SCN的信号输入强度,表明在昼夜节律调控的环路中PACAP是谷氨酸日节律重要的信号调质。