膀胱癌是泌尿系统常见恶性病变,居男性恶性肿瘤发病率第四位,死亡率第八位。尽管大部分新发患者可以通过经尿道膀胱肿瘤电切(TUR-Bt)治疗,但术后肿瘤复发率高,因此,如何降低患者术后肿瘤复发率是目前膀胱癌相关研究的焦点。目前研究已显示术后膀胱灌注化疗和免疫治疗可以降低患者术后复发率,但现有药物对术后肿瘤复发率缓解作用有限,且部分副作用难以耐受,需要进一步寻找安全高效的药物来降低膀胱癌患者TUR-Bt术后复发的难题。薄荷醇是从唇形科植物薄荷中提取的薄荷挥发油中主要成分,是一种已被应用了几千年的植物药,并被美国食品药品管理局(FDA)视为安全无毒药物,在医药食品等多领域广泛应用。研究表明薄荷醇对前列腺癌、黑色素瘤、白血病、胃癌等癌细胞生长有抑制作用,但同时也有试验提示薄荷醇可以促进神经内分泌瘤细胞、神经胶质母细胞瘤细胞的分泌功能及迁徙能力,促进肿瘤的生长。而就其机制而言,研究已显示薄荷醇不但能通过其特异性受体一瞬时受体电位通道M8(TRPM8,或称为CMR1或Trpp8)抑制肿瘤生长,尚可通过非TRPM8通道抑制肿瘤细胞的生长。因此,薄荷醇与恶性肿瘤之间的研究才拉开序幕。本课题拟分三部分来探讨薄荷醇对膀胱癌增殖的影响及机制,以期为膀胱癌的临床治疗和薄荷醇的新药开发奠定理论基础。本课题的创新点：1)首次观察了人膀胱癌细胞系T24细胞中TRPM8通道的表达和功能情况；2)首次观察了薄荷醇对T24细胞增殖的影响；3)深入探讨了薄荷醇调节肿瘤细胞生长的可能机制。第一章人膀胱癌T24细胞中TRPM8的表达及活性的研究目的：探讨人膀胱癌T24细胞中是否存在TRPM8通道的表达及其亚细胞结构分布和功能方法：体外常规培养人膀胱癌T24细胞、HEK293细胞及HEK293-TRPM8细胞,使用Trizol法和RIPA法分别提取细胞总RNA和总蛋白,进一步使用聚合酶链式反应(PCR)和western蛋白印迹试验(western blotting)分别检测TRPM8基因的mRNA和蛋白表达情况。并使用免疫荧光杂交检测在共聚焦显微镜下观察人膀胱癌T24细胞TRPM8蛋白的表达及分布。利用钙成像技术检测T24细胞中TRPM8通道在低温刺激下对钙离子(Ca2+)的调控功能。结果：1)人膀胱癌细胞系T24细胞表达TRPM8 mRNA及蛋白PCR产物通过凝胶电泳分离后,T24细胞和HEK-293-TRPM8细胞(阳性对照),在200bp和300-400bp之间可以清晰看到两条亮带,而HEK-293细胞(阴性对照),与试验设计PCR产物吻合,表明T24细胞表达TRPM8 mRNA。进一步western-blotting检测显示T24细胞和HEK-293-TRPM8细胞在35KD附近及130KD附近出现两条特异性条带,与TRPM8和GAPDH蛋白分子量基本吻合,表明T24细胞表达TRPM8蛋白。试验初步表明人膀胱癌细胞系T24细胞表达TRPM8 mRNA及蛋白。2)TRPM8在T24细胞的细胞核外表达为进一步证实上述结果,试验中应用免疫荧光杂交反应观察了TRPM8蛋白在T24细胞的表达和分布。结果显示,Cy3红色荧光在T24细胞的细胞核外充分结合表达,表明细胞核外存在与TRPM8蛋白结合的特异性anti-TRPM8抗体,从而进一步证实T24细胞存在TRPM8蛋白表达,且可能分布于细胞核外,细胞膜和／或胞浆细胞器。3)人膀胱癌T24细胞细胞表达具有生物活性的TRPM8通道试验结果显示,在37℃状态下平衡20s后,当温度调节至20℃时,T24细胞内Fura3-AM荧光增强,表明细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高,当温度降至7℃时,荧光进一步增强,表明[Ca2+]i进一步升高。虽然冷温刺激下,含Ca2+和无Ca2+的HBSS溶液均可导致[Ca2+]i升高,但无Ca2+状态下,[Ca2+]i升高低于含Ca2+状态,尤以7℃时明显。这表明TRPM8通道在T24细胞中具有生物活性,可以介导外界冷刺激,导致细胞内Ca2+增高；另外,该试验也表明TRPM8在T24细胞的胞膜和胞浆均有分布。结论：人膀胱癌细胞系T24细胞表达具有活性功能的TRPM8通道,可以介导Ca2+通透,且TRPM8蛋白在T24细胞的细胞核外细胞器表达,分布于胞膜和胞浆。第二章薄荷醇抑制人膀胱癌细胞株T24细胞增殖的研究目的：探讨TRPM8通道及薄荷醇对人膀胱癌T24细胞增殖的影响方法：利用基因调控技术构建pcDNA3-TRPM8表达型质粒和siRNA-TRPM8干扰单体,调控T24细胞中TRPM8的表达,并使用CCK-8检测观察,在TRPM8蛋白表达变化时,T24细胞的增殖情况。同时使用TRPM8通道的激活剂-薄荷醇干预,观察T24细胞的增殖情况。进一步使用薄荷醇和siRNA-TRPM8单体共同干预T24细胞,CCK-8检测观察T24细胞的增殖情况,以了解TRPM8通道的增殖活性。统计学数据均以x±s表示,统计学采用单因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有统计学意义。结果：1)TRPM8表达变化不影响T24细胞的增殖为观察TRPM8表达对人膀胱癌细胞系T24细胞的增殖的影响,试验中使用CCK-8试剂检测了TRPM8表达变化时细胞的增殖情况,结果显示：对照组、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、pcDNA3和pcDNA3-TRPM8各干预组(n=9)的光密度(OD值)依次为0.580±0.041、0.535±0.043、0.545±0.079、0.526±0.06、0.532±0.07和0.538±0.04；统计学方差分析显示：总体样本F值=1.037,p值=0.407,样本间无差异。表明TRPM8表达的变化并不影响T24细胞的生长。2)薄荷醇呈剂量依赖性抑制人膀胱癌细胞系T24细胞生长为进一步了解TRPM8通道在T24细胞中的作用,试验中使用TRPM8通道的激动剂-薄荷醇(menthol)对细胞进行干预并观察其生长状况。结果显示,OuM、10uM、100uM、500uM、1000uM和2000uM menthol干预组(n=9)的OD值依次为0.820±0.064、0.701±0.072、0.611±0.059、0.548±0.072、0.454±0.054和0.355±0.040；统计学方差分析显示：总体样本F值=67.340,p值=0.000,存在样本差异；组间比较显示,均p<0.05,存在统计学差异。表明薄荷醇呈剂量依赖性抑制T24细胞的生长。3)薄荷醇依赖TRPM8通道抑制人膀胱癌细胞系T24细胞的生长试验中进一步使用siRNA预先沉默T24细胞中TRPM8表达,再观察薄荷醇对T24细胞的抑制作用。结果显示对照组(menthol=OuM)、siRNA+menthol(1000uM)组及menthol(1000uM)组的OD值依次为0.782±0.042、0.738±0.043、0.452±0.065；统计学方差分析显示：整体样本F值=111.145,p值=0.000,存在样本间差异。组间对比发现,与对照组相比,siRNA+menthol组的p=0.075,而menthol组p=0.000；而与siRNA+menthol比较时,仅menthol组p=0.000,有显著性差异。本试验提示薄荷醇需依赖T24细胞中TRPM8通道的活性进一步抑制T24细胞的生长。结论：对于人膀胱癌T24细胞,TRPM8蛋白的表达变化不影响其生长增殖,但TRPM8通道的激活剂-薄荷醇,可以呈剂量依赖性抑制T24细胞的生长,但该种效应需要TRPM8通道参与。第三章薄荷醇抑制人膀胱癌T24细胞生长的机制的研究目的：探讨薄荷醇抑制人膀胱癌T24细胞生长的机制方法：利用流式细胞学细胞筛选法,分别使用PI单染和Annexin V-FITC/PI双染观察不同浓度薄荷醇干预下,T24细胞的各细胞周期细胞比例及凋亡和死亡细胞比例。进一步使用钙成像技术,检测不同浓度薄荷醇对T24细胞内[Ca2+]i的影响。并使用JC-1荧光探针法和DCFH-DA荧光探针法在共聚焦显微镜下分别观察不同浓度薄荷醇对T24细胞中线粒体膜电位和细胞内活性氧(ROS)的影响。再进一步使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和薄荷醇共同干预,CCK-8检测观察其对T24细胞增殖的影响。最后使用western蛋白印迹法检测ROS生长相关通路信号蛋白的表达变化。统计学数据均以x±s表示,统计学采用单因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有统计学意义。结果：1)薄荷醇不能诱导人膀胱癌T24细胞细胞周期阻滞流式细胞学细胞周期筛选结果显示0、10、100、500、1000、2000uM各浓度作用下,S期细胞比例分别为：39.463±3.042%、38.867±3.056%、37.383±3.049%、37.643±2.338%、37.81±2.511%和37.617±2.447%；方差分析提示：整体样本F=0.274,p=0.918,样本间没有统计学差异。G0／G1期分别为47.733±3.477%、47.737±5.877%、46.667±1.475%、48.267±5.524%、48.977±1.66%及47.96±3.144%；同样方差分析提示：整体样本F值为0.112,p值为0.987,样本间无差异。G2／M期为：12.803±1.819%、13.397±2.913%、15.95±4.518%、14.09±3.683%、13.213±2.368%和14.423±3.888%；方差分析提示：整体样本F=0.347,p=0.875,表明样本间没有统计学差异。试验结果提示薄荷醇不能诱导T24细胞的细胞周期阻滞。2)薄荷醇诱导人膀胱癌T24细胞死亡Annexin V-FITC/PI双染结果显示,薄荷醇各干预组细胞凋亡率依次为OuM(3.663±0.479%)、10uM(3.353±1.577%)、100uM(3.273±0.355%)、500uM(3.81±0.655%)、1000uM(3.4±0.9%)、2000uM(3.54±0.694%);统计学分析显示,整体样本F值为0.163,p值为0.971,无样本差异。而死亡细胞明显增加,相对于对照组(薄荷醇=0uM,细胞死亡率0.99±0.24%),10、100、500、1000、2000uM各浓度作用下,细胞死亡率依次为13.973±319%、26.2±3.573%、35.11±2.983%、48.463±4.149%及70.467±5.118%,呈明显的剂量依赖性；统计学分析显示,整体样本F=145.566,p=0.000,样本见存在显著性差异；组间比较显示,各组间均p<0.05,有显著性差异。结果表明薄荷醇可以诱导T24细胞死亡,而非凋亡。3)薄荷醇诱导人膀胱癌细胞系T24细胞[Ca2+]i增加钙成像技术检测显示,T24细胞在负载Fluo-3AM后,相比对照组(薄荷醇=OuM),100uM、1000uM、2000uM薄荷醇均可诱发T24细胞瞬间荧光增强,由于钙成像技术中,荧光强度与[Ca2+]i威正比,因此本实验提示薄荷醇可以诱导T24细胞[Ca2+]i增加,并且随薄荷醇浓度增加而增高,显示剂量依赖趋势。4)薄荷醇诱导T24细胞线粒体膜的去极化JC-1荧光染探针检测显示,当薄荷醇浓度达到100uM时,其明显降低T24细胞所激发的红／绿色荧光比值(红／绿色荧光比值与线粒体膜电位呈正比,本试验中以两者比值代表线粒体膜电位),即降低线粒体膜电位。各组红／绿色荧光比值依次为,OuM(0.886±0.119),10uM(0.801±0.027).100uM(0.729±0.049)、500uM(0.588±0.025)、1000uM(0.512±0.026)、2000uM(0.307±0.0309);统计学分析显示,整体样本F值为122.866,p值为0.000,表明存在样本间差异；组间比较显示,除对照组与10uM细胞组之间比较时p=0.508,无统计学差异,而其他各组间均p<0.05,有统计学差异。表明当薄荷醇达到100uM时,可呈剂量依赖性降低T24细胞线粒体膜电位。5)薄荷醇增加T24细胞内ROS产生DCFH-DA荧光探针检测显示,各组T24细胞红色荧光值依次为0uM(344.222±32.081)、10uM(447.111±55.784)、100uM(514.444±72.224),500uM (618.889±95.995)、1000uM(757.667±74.746)、2000uM(866.556±76.069);方差分析显示,整体样本F值为69.226,p值为0.000,存在样本间差异；组间比较显示,各组均p<0.05，有统计学差异。表明薄荷醇呈剂量依赖性诱导T24细胞内ROS的产生。6)NAC(ROS清除剂)可以逆转薄荷醇对T24细胞增殖的影响NAC与薄荷醇共同干预下,CCK-8试剂检测显示,各组细胞OD值分别为：对照组0.705±0.06,NAC组0.726±0.079,menthol组0.418±0.102,menthol+NAC组为0.693±0.559。统计学分析显示,整体样本F值为32.792,p值为0.000,存在样本间差异；组间比较显示,与对照组相比,NAC组p=0.982,menthol组p=0.000,且menthol+NAC组p=0.998；而与NAC组比较时,menthol+NAC组p=0.872,而menthol组p=0.000；且与]menthol+NAC组比较时,仅menthol组p=0.000。表明仅1000uM薄荷醇可以诱导T24细胞生长抑制,但NAC可以逆转其生长抑制作用。7)薄荷醇通过ROS/Ras/ERK1/2调控通路诱导T24细胞生长抑制为进一步探讨薄荷醇诱导T24细胞死亡的ROS下游可能通路,试验中进一步检测了ROS生长相关信号通路的经典通路蛋白。结果显示10mMNAC可以阻断1000uM薄荷醇诱导的T24细胞内ROS产生。且蛋白印迹检测进一步提示薄荷醇可以降低Ras蛋白表达,并全面抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2通路蛋白的磷酸化状态,但NAC可以逆转这种变化；但薄荷醇对于T24细胞中的p38和JNK蛋白,及它们的磷酸化蛋白没有影响。结果表明,ROS/Ras/ERK1/2通路可能参与了薄荷醇诱导T24细胞死亡的过程。结论：薄荷醇通过增加人膀胱癌T24细胞内[Ca2+]i,导致线粒体去极化或非线粒体通路激活,而诱发细胞内ROS的产生,并进一步抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路,最终导致T24细胞死亡而出现生长抑制。