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背景:在全球范围内,宫颈癌仍然是女性最常见的癌症之一,是仅次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌的第四大常见癌症。目前对于宫颈癌的治疗策略是通过手术和放疗以进行局部治疗,随着疾病的进展,可考虑进行多学科治疗和化疗。然而传统治疗方式存在着各种弊端,比如部分患者手术后会发生严重的并发症;晚期宫颈癌放射敏感性低,无法取得令人满意的治疗效果;复发性宫颈癌的治疗方法有限,预后差。另外,部分年轻宫颈癌患者有保留生育能力的需求,而部分老年患者不能耐受传统的放化疗及手术治疗。因此,亟需一种能够有效杀伤宫颈癌细胞的微创治疗方案。目的:制备一种携带IR780、全氟己烷（PFH）及二亚乙基三胺五乙酸钆（Gd-DTPA）的诊疗一体化纳米探针（简称IGP@P纳米粒）,在低强度聚焦超声（LIFU）辐照下实现对宫颈癌细胞的序贯杀伤作用,并借助光声（PA）及磁共振（MR）分子影像学实现对宫颈癌的靶向特异性诊断及治疗效果评估。方法:1.诊疗一体化纳米探针IGP@P的制备及表征:采用超声乳化法制备靶向宫颈癌He La细胞的诊疗一体化纳米探针。动态光散射法（DLS）检测纳米粒的粒径和Zeta电位。扫描电镜（SEM）用于表征IGP@P纳米粒的三维结构。激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）用于表征1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐（Di I）标记的红色荧光IGP@P纳米粒。高分辨透射电镜（HRTEM）用于检测包含电子致密物钆（Gd）的IGP@P纳米粒和不含Gd的IP@P纳米粒的形态和结构,结合能量色散光谱仪（EDS）观察纳米粒中的碘（I）,Gd,氟（F）元素的分布。电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）用于测定每组含Gd纳米粒中Gd-DTPA的包封率。使用紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR）分光光度计测定在IG@P和IGP@P纳米粒中IR780的包封率。评估体外IGP@P纳米粒的PA及MR成像能力。2.LIFU辐照下诊疗一体化纳米探针对体外宫颈癌He La细胞的靶向及治疗评估:借助CLSM评估He La细胞对纳米粒的靶向摄取,并通过其与线粒体的共定位进一步验证IGP@P纳米粒对线粒体的靶向亲和能力。测定体外LIFU辐照不同时间后（辐照功率2.5 W/cm~2;辐照时间2分钟、4分钟、6分钟）IGP@P纳米粒中活性氧（ROS）的生成,并在相应时间点用光学显微镜观察纳米粒发生声致相变（ADV）效应的特征。从细胞水平评估LIFU辐照前后He La细胞内ROS的产生、纳米粒的相变以及He La细胞的凋亡/坏死率,以分析体外细胞层面的治疗效果和治疗机制。通过CCK-8法测定纳米粒对体外细胞的安全性。3.LIFU辐照促进诊疗一体化纳米探针对宫颈癌渗透的体内外实验:在体外水平,验证LIFU辐照对促进IGP@P纳米粒对3D多细胞肿瘤球体（MCTSs）的穿透能力。在体内水平,通过PA及MR影像学评估IGP@P纳米粒对裸鼠肿瘤的靶向性,并借助MR T1加权图像（T1WI）验证首次促渗透性LIFU辐照对促进IGP@P纳米粒向肿瘤内部渗透的能力。4.再次治疗性LIFU辐照后的声动力疗法（SDT）和ADV效应对宫颈癌序贯增效治疗的体内实验:MR T2加权图像（T2WI）用于评估再次治疗性LIFU辐照后裸鼠肿瘤的T2信号变化,并与病理切片对照分析体内治疗机制。对载瘤裸鼠进行IGP@P+LIFU辐照治疗,持续16天观察裸鼠肿瘤体积变化及裸鼠体重变化,以评估该治疗方法的长期有效性。治疗完成后检测裸鼠血液学指标并收集裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏做病理切片分析,以评估IGP@P纳米粒治疗宫颈癌的体内安全性。结果:1.以聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）为载体,将IR780负载到纳米粒的壳上,将Gd-DTPA和PFH包封到纳米粒的核中,通过超声乳化法成功制备IGP@P纳米粒,该纳米粒呈球形、粒径均一,具备良好的分散性。IGP@P纳米粒的平均粒径为174.5±3.10 nm,Zeta电位为-5.5±3.31 m V。HRTEM图像显示IGP@P纳米粒中电子致密物Gd的存在,EDS显示I元素呈环状均匀的分布在纳米粒壳上,Gd元素和F元素均匀分布在纳米粒的核中。IGP@P纳米粒中Gd-DTPA的包封率为57.60±5.42%,IR780的包封率为67.39±4.07%。对纳米粒的PA及MR成像能力进行评估,显示PA强度随着IGP@P纳米粒浓度的增加而增加并且呈线性相关;同时IGP@P纳米粒具有良好的MR正性对比增强能力。2.CLSM显示IGP@P纳米粒不仅对He La细胞具有高亲和力,能够被He La细胞大量内吞,而且由于IR780的辅助,可以选择性地实现对细胞内的线粒体定位。体外LIFU辐照IGP@P纳米粒后显示,在本实验条件下,IGP@P纳米粒中的IR780在辐照2分钟和4分钟后可被诱导产生大量的ROS,当辐照时间延长至6分钟时,ROS的产生显着减少;IGP@P纳米粒中PFH的相变随着辐照时间延长逐渐明显,在LIFU辐照6分钟后可以发生广泛而充分的相变。细胞实验显示,在IGP@P+LIFU组中,在LIFU辐照前半程主要依靠ROS来实现抗肿瘤作用,后半程主要依赖于ADV作用,从而产生针对肿瘤细胞的级联放大序贯疗法。CCK-8法显示IGP@P纳米粒具有可靠的细胞安全性。3.LIFU辐照后,CLSM显示大量Di I标记的红色荧光IGP@P纳米粒穿透肿瘤并均匀分布在整个3D MCTSs中,证实体外的LIFU辐照可以帮助IGP@P纳米粒渗透到肿瘤内部。体内PA成像显示肿瘤区域的PA强度随着时间的延长而逐渐增加,并在注射IGP@P纳米粒12小时后达到峰值。体内MR成像中,在注射IGP@P纳米粒后3小时及6小时后,T1WI显示肿瘤区域的T1信号逐渐增高。在IGP@P纳米粒注射6小时后,我们在肿瘤部位施加了首次促渗透性LIFU辐照,辐照后6小时的T1WI显示,和未施加首次促渗透性LIFU辐照的组相比,肿瘤部位T1信号进一步增强,表明大量IGP@P纳米粒在肿瘤处累积。4.在向裸鼠体内注射IGP@P纳米粒12小时后,施加再次治疗性LIFU辐照,辐照后6小时,MR T2WI显示肿瘤区域T2信号不均匀降低。病理切片显示IGP@P+LIFU组瘤体间质有散在出血点,细胞核、细胞膜结构模糊。病理切片和MR均提示肿瘤在再次治疗性LIFU辐照后发生了凝固性坏死。在对载瘤裸鼠治疗后为期16天的观察中,显示IGP@P+LIFU组中肿瘤的体积逐渐缩小。结论:本实验中,我们设计并制备了携带IR780和PFH的IGP@P纳米粒,该纳米粒对He La细胞具有高亲和力,并且由于IR780的辅助,可以选择性地实现细胞内的线粒体定位。在LIFU辐照下,IR780产生的ROS和PFH相变所诱发的ADV效应可以实现对宫颈癌的协同微创治疗。LIFU辐照在本实验中发挥着促渗透及协同治疗两大作用。我们使用首次促渗透性LIFU辐照并验证其促进纳米粒向3D MCTSs和裸鼠肿瘤中渗透的能力;然后在再次治疗性LIFU辐照下,纳米粒中携带的IR780通过SDT产生ROS,ROS已被证明可诱导肿瘤细胞凋亡,但由于肿瘤的缺氧微环境,再次治疗性LIFU辐照的前半部分产生的ROS不足以发挥强有力的抗肿瘤作用,因此在再次治疗性LIFU辐照的后半段,纳米粒中携带的PFH发生相变后产生的物理ADV效应在体外和体内实现了序贯的抗肿瘤效应。将ROS+ADV效应联系起来可以诱导细胞凝固性坏死,并对肿瘤组织产生全面、长期的影响。我们应用编程良好的LIFU辐照来促进纳米粒渗透到深部肿瘤组织并同时达到抗肿瘤作用。此外,由于纳米粒子装载的IR780和Gd-DTPA,我们使用PA和MR成像来监测和评估这些纳米粒子对肿瘤组织的靶向和治疗效果,提供了一种针对宫颈癌的微创诊疗一体化纳米平台。