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胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)是消化道最常见的间叶组织肿瘤。目前普遍认为GISTs起源于向cajal细胞分化的原始间叶细胞或幼稚干细胞,具有多向分化特征,可以向平滑肌、神经分化或不定向分化,是一种具有恶性潜能的胃肠道肿瘤,但其确切起源尚不明确。其发病率为1~2/10万人口,似乎正逐渐增加。近年来有研究表明,PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)和MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路活性在胃肠道间质瘤显著增高。MAPK通路和PI3K通路是传递细胞增殖信号的两个重要通路,二者之间存在一定程度的相互作用,而FOXO1蛋白正处于这两种信号途径的共同交汇点,参与细胞增殖与凋亡调节。FOXO是Forkhead蛋白家族的一个亚群,其中FOXO1是FOXO家族中发现最早的成员之一。有研究证实FOXO1是抑癌基因,能够影响肿瘤的发生、发展。PI3K/Akt(磷脂酰肌醇-3-激酶)和MAPK/ERK MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号传导通路均可调节FOXO1转录因子的活性,在这两条信号通路异常激活的作用下,FOXO1蛋白分子中的保守性位点发生磷酸化并从胞核输出,与14-3-3蛋白在胞质内结合,从而封闭了自身的核定位序列并定位于胞质中,远离了其自身的靶基因,进而抑制了FOXO1因子对靶基因的转录调控,并通过调节下游细胞周期及凋亡相关信号分子Bim、Bcl2、Bax等,影响细胞周期的进程和凋亡事件。已有研究指出下调FOXO1能够促进肿瘤细胞的增殖,但其确切机制尚不清楚。 目的:本实验选取WI-38细胞(人成纤维细胞)与GIST-T1(胃间质瘤细胞)作为研究对象。采用PI3K信号通路抑制剂LY294002和MAPK信号通路特异性抑制剂UO126单独或联合处理细胞,研究胃间质瘤中FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达,以及PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)和MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路对FOXO1的活性调节对胃间质瘤细胞生物学行为的影响。研究胃间质瘤中FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达,以及PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)和MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路对FOXO1的活性调节对胃间质瘤细胞生物学行为的影响。 方法:采用免疫细胞化学染色对GIST-T1细胞系进行鉴定;Western blot检测FOXO1、Bcl2、Bax蛋白在胃间质瘤细胞系GIST-T1中的表达,以及PI3K信号通路抑制剂LY294002和MAPK信号通路特异性抑制剂UO126单独或联合处理细胞后FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax等相关蛋白表达的变化;CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;免疫荧光法检测FOXO1蛋白在GIST-T1细胞中的细胞定位的变化。流式细胞术检测药物作用后细胞凋亡及细胞周期变化。 结果:细胞c-kit免疫细胞化学染色结果阳性。CCK-8结果显示,LY294002和UO126单独、联合处理组GIST-T1细胞较DMSO组增殖明显受到抑制(P<0.05),且呈时间依赖性。Western blot结果显示,与对照组WI-38细胞(人成纤维细胞)相比,GIST-T1细胞中总FOXO1蛋白及Bax蛋白表达相对较低,p-FOXO1、Bcl2蛋白表达相对较高。LY294002和UO126单独、联合处理后,总FOXO1蛋白表达水平未见明显变化(P>0.05),而p-FOXO1及Bcl2蛋白表达下降(P<0.05),Bax蛋白的表达增加(P<0.05)。免疫荧光显示药物处理后FOXO1在GIST-T1细胞中的细胞核移位明显增多。LY294002和UO126联合处理GIST-T1细胞较药物单独应用时蛋白表达变化及细胞定位变化均增加(P<0.05)。流式细胞仪检测发现药物处理组细胞凋亡明显增加,细胞周期G1期细胞比例增加,S期细胞比例下降,且联合用药组作用效果更加显著。 结论:培养的GIST-T1细胞c-kit免疫细胞化学染色阳性;PI3K和MAPK抑制剂能够抑制胃肠道间质瘤细胞系GIST-T1细胞增殖。PI3K和MAPK抑制剂能够通过调节FOXO1磷酸化,使FOXO1由胞浆向胞核移位;PI3K和MAPK抑制剂能够增强FOXO1转录活性,调节下游Bcl2和Bax的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡;PIK和MAPK抑制剂在抑制GIST-T1细胞增殖,促进GIST-T1细胞凋亡方面具有交互作用。