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目的:本研究旨在通过建立代谢组学实验平台,对照分析动物成骨肉瘤(Osteosarcoma;OS)实验模型与临床OS、良性骨肿瘤患者的血清/尿液特征代谢产物,分别应用偏最小方差判别分析法(Partial least square-discriminate analysis;PLS-DA)等方法建立OS代谢谱数学模型,采用相应的可视化技术,通过对动物模型及OS患者的血液及尿液中的代谢产物参比研究,建立分辨率高,重复性好的OS血清、尿液代谢标志物组,并试图从机体的动态代谢途径寻找OS诊断标志物。方法:本研究分3部分进行1.建立模型动物OS的代谢谱。通过实验建立MG-63(人成骨肉瘤细胞株)C3H鼠模型和健康对照组,采用氯甲酸乙酯(Ethyl Chloroformate;ECF)衍生的气质联用(Gas chromatography/mass spectrometry;GC/MS)技术平台,分别观察模型鼠荷瘤后第3、5、7周的内源性小分子代谢谱相对于健康对照组尿液的变化。用主成分分析(Principal component analysis, PCA)的方法,判断荷瘤鼠同一时间点的尿液样本代谢谱轮廓和趋势;通过分析影响PLS-DA模型中的权重较大的变量(Variable importance inprojection;VIP),鉴定差异代谢产物中主成分。2.建立临床骨肿瘤(Benign /Osteosarcoma)的代谢谱。将13名OS患者,18名良性肿瘤患者和20名健康对照人群分成3组,通过ECF衍生GC/MS技术平台对三组尿液样本代谢进行分析;同步基于三甲基硅烷(Trimethylsilyl;TMS)衍生的气相色谱飞行时间质谱联用分析(Gas chromatography/Time-of-flight mass spectrometry;GC/TOF-MS)分析的方法,考察三组血清样本。以此分别得到三组血清/尿液样本的代谢物谱变化。继而通过PCA的方法和PLS-DA,首先对比骨肿瘤组与健康对照组,进一步区分良性骨肿瘤和OS组,并判断模型中的VIP,鉴定出代谢产物中比较明显的成分(Principal components;PC)。3. OS代谢标记物与代谢通路相关的综合分析。将实验鼠和临床研究的结果予以对比,得出交集的代谢产物,在Metabolic Pathway以及KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)数据库进行代谢通路的查询。通过综合分析,获得OS在发生发展过程中内源性小分子比较明显的代谢变化,推测OS代谢诊断标记物、主要代谢通路以及影响其代谢通路的关键酶。结果:1.实验中发现伴随着OS的形成与进展,PCA和PLS-DA等多维统计方法结果显示小鼠在实验第3周开始出现偏移、第5周已经初步显现分离趋势,第7周已经完全可以区分。利用PLS-DA模型实验中找出的与OS形成相关的37个差异代谢物,并利用NIST谱库等数据库,鉴定了其中10个代谢物。其中马尿酸,尿素,L-鸟氨酸在荷瘤组中含量较健康对照组低,而腐胺,亚精胺,异柠檬酸等含量较健康对照组高。2.利用非监督的PCA方法,得到健康对照组与骨肿瘤患者(Benign /Osteosarcoma)代谢谱的分离趋势。进一步利用监督的正交偏最小方差判别分析(Orthogonal Partialleast square-discriminant analysis OPLS-DA)的方法能清晰地观察到OS、良性骨肿瘤患者与正常对照之间的代谢轮廓的差异,得到与OS临床病理相关的代谢通路的变化。血清代谢组学分析中:核糖醇、D-果糖、2 -酮戊二酸、乳酸、丁醛、丁酸、甘氨酸、a-氨基己二酸、L-鸟氨酸、甲基组氨酸、L-缬氨酸、十二烷酸等代谢物在OS患者血清中明显低于良性骨肿瘤患者;而瓜氨酸、L-酪氨酸、尿素、半乳糖、2-脱氧-D-半乳糖、硬脂酸、α-羟基丁酸等代谢物在OS患者血清中含量明显高于良性骨肿瘤。在尿液代谢组学分析中:甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、高香草酸、乳酸、柠檬酸等代谢物在OS患者尿液中含量明显低于良性骨肿瘤患者;马尿酸、谷氨酸、组胺、胱氨酸、腐胺等代谢物在OS患者尿液中含量明显高于良性骨肿瘤患者。3.我们发现了OS代谢产物的主要共同通路异常为肿瘤能量代谢异常和鸟氨酸循环-多胺代谢的异常。在OS尿液代谢组学研究中,柠檬酸、马尿酸盐、腐胺、亚精胺,鸟氨酸可能成为代谢诊断的标志物,关键酶推测是鸟氨酸脱羧酶(Ornithimedecarboxylase,ODC),谷胱甘肽-S-转移酶(Gultathione S transferases;GST)的同工酶和GSTM1、GSTT1。OS血清代谢组学研究结果显示,苹果酸、十二烷酸、羊毛硫氨酸、有可能成为代谢诊断的标志物,推测的关键酶是鸟氨酸循环中负责调控/转运N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthetase;NAGAS)和鸟氨酸转移酶(Ornithinecarbamyl transferase;OCT)。4.代谢差异结果表明:OS不仅影响了糖类、脂类和蛋自质三大物质的代谢,还对能量代谢、鸟氨酸循环-多胺代谢等多个生理系统产生显著影响,并且可能直接导致代谢通路损伤。结论:1.基于ECF和TMS衍生的GC/MS的OS代谢组学实验平台,进行OS动物模型和临床OS患者的血/尿液的代谢组学研究,能够初步得到良性,恶性和健康对照人群组别代谢轮廓的分离趋势,表明基于色谱/质谱的尿样代谢组学方法在OS的早期诊断上有很大的潜力。2.本研究中基于GC/TOF-MS的血清代谢组学方法同样比较稳定,可以清楚的区分OS、良性肿瘤和正常人的血清代谢轮廓。3.本实验证明:在模型动物实验和OS临床患者的尿液/血清的代谢组学研究中,证实能量代谢异常和鸟氨酸循环-多胺代谢等代谢通路碍在OS发生、发展病理过程中具有重要作用,与OS形成、恶化和转移具有重要相关性,有待于后续验证。本论文创新性研究成果:1.首次通过GC/MS和GC/TOF-MS实验平台对OS代谢组学进行研究,不但可以得到健康组与OS组代谢轮廓分离趋势,并可以进一步鉴别区分良性骨肿瘤与OS代谢模式。2.探索性地将动物实验与临床研究获得的结果进行整合分析,血清/尿液样本代谢组学分析结果交互验证,可以得到相对稳定的OS代谢标记物,可能启发基于色谱/质谱技术的代谢组学方法在OS的早期诊断的新思路。3.发现人与动物OS共同代谢通路为能量代谢,鸟氨酸循环-多胺代谢障碍为主导,得出重要结论:能量代谢障碍、鸟氨酸循环-多胺代谢等代谢通路障碍可能是OS的发生、发展、转移病理过程中重要的代谢模式,为OS代谢通路纵深研究提供了重要科学证据。