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目的:本研究将使用MSP或BSP检测前列腺癌组织、正常前列腺组织与前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)及正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)中miR-34a的启动子区甲基化水平;通过QPCR检测获取前列腺癌细胞系经抑制甲基化处理前后的miR-34a及ATG4B的表达水平;通过双荧光素酶报告基因检测miR-34a与ATG4B在前列腺癌细胞中是否存在直接靶向性关系。以期为前列腺化疗提供新的理论基础及基因治疗提供新的靶点。方法:第一部分,内源检测:1、收集前列腺癌组织与正常组织各25例,MSP检测miR-34a启动子甲基化状态;2、QPCR检测癌症组织与癌旁组织中miR-34a的mRNA表达水平;3、MSP检测前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)及正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)中miR-34a的启动子区甲基化状态;4、QPCR 检测 RWPE-1、PC-3、DU145 中 miR-34a、ATG4B 的 mRNA 表达水平。第二部分,靶基因验证:1、甲基化抑制剂5’-杂氮脱氧胞苷处理PC-3、DU145两株前列腺癌细胞系(时间:48h浓度:10umol/L);2、miR-34a的模拟物转染前列腺癌细胞系48h;3、QPCR检测经转染或去甲基化处理PC-3、DU145 中 miR-34a、ATG4B 的 mRNA 表达水平;4、WB 检测 ATG4B、Beclinl、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白表达水平;5、MTT检测细胞增值情况;6、WB检测凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2;7、双荧光素酶报告基因检测miR-34a与ATG4B在前列腺癌细胞中的直接靶向关系。结果:MSP检测结果显示,前列腺癌细胞系PC-3和DU145的miR-34a启动子区的甲基化程度明显高于正常人前列腺上皮细胞RWPE-1,前列腺癌组织中miR-34a启动子区的甲基化程度亦明显高于癌旁组织。QPCR检测结果显示,在前列腺癌组织以及前列腺癌细胞系PC-3和DU145中,miR-34a的表达水平明显低于前列腺癌癌旁组织和RWPE-1细胞。而在前列腺癌细胞系PC-3和DU145中,ATG4B的mRNA水平则明显则明显高于RWPE-1细胞。经去甲基化处理或miR-34a的mimics转染后,PC-3和DU145细胞系中miR-34a的表达明显升高,而其ATG4B的mRNA的表达显著降低。WB检测显示凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、和Bax在转染后的PC-3和DU145细胞系中均显著上调,而自噬相关蛋白ATG4B、Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ在转染后的PC-3和DU145细胞系中都显示明显下调。双荧光素酶报告基因检测显示,在PC-3细胞和DU145细胞中构建ATG4B-3’-UTR片段均抑制荧光素酶活性,与之相对照,经miR-34a转染抑制及空白对照组的荧光素酶活性均无改变。结论:1、MiR-34a在前列腺癌组织中的表达因其DNA甲基化而下调;2、前列腺癌细胞系中miR-34a的甲基化使得miR-34a低表达,而ATG4B高表达;3、在前列腺癌细胞中ATG4B是miR-34a的靶向作用目标,上调miR-34a能降低ATG4B的表达并促进前列腺癌细胞的细胞凋亡。