论文部分内容阅读
目的: 牙周炎作为人类口腔最常见的三大疾病之一，可导致牙周软硬组织，特别是牙槽骨的吸收，使得牙周炎患牙松动、脱落，是成人失牙最主要的原因。牙周膜中的牙周膜细胞(Periodontal Ligament Cells，PDLCs)具有多向分化的潜能，能分化成成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等，在牙周组织修复再生中发挥重要作用。然而PDLCs骨向分化的调控机制极为复杂，存在多条信号途径，如一氧化氮(Nitric oxide，NO)、前列腺素（Prostaglandins）、钙离子通道等。 内源性硫化氢（Hydrogen sulfide，H2S），是近期发现的继一氧化碳(Carbonmonoxide，CO)、一氧化氮之后的第三大气体信号分子，能在细胞内合成，通过自由扩散至细胞外参与调节众多人体生理功能，如大脑发育、血压调节和炎症反应等。体内H2S合成异常，可导致多种系统性疾病，如晶状体脱落、早发性动脉硬化、血栓和骨质疏松等。体外研究表明，低浓度的内源性H2S能促进MC3T3-E1细胞成骨分化。体内研究也证实，内源性H2S可通过调节钙离子通道，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而参与调节骨髓间充质干细胞(Bone MarrowMesenchymal Stem Cells，BMMSCs)的自我更新和成骨分化。其中Wnt/β-catenin信号通路是细胞增殖分化的关键调控途径，在骨代谢中发挥着重要作用。但是目前尚无证据表明PDLCs是否也能合成内源性H2S，从而通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与PDLCs骨向分化的调控。因此，本研究旨在探讨内源性H2S在原代PDLCs中的合成机制及对与成骨分化的调控作用，为牙周组织再生指导临床牙周炎治疗提供新思路和实验依据。 方法: 收集因阻生拔除的第三磨牙，酶消化结合组织块法原代培养人牙周膜细胞(Human Periodontal Ligament Cells，hPDLCs)。取3-5代生长状态良好、性状稳定的hPDLCs用于实验。采用MTT法检测H2S对hPDLCs增殖的影响。hPDLCs与不同浓度的H2S体外供体硫氢化钠(NaHS)以及H2S合成酶胱硫醚β-合成酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE）抑制剂D，L-炔丙基甘氨酸(D，L-propargylglycine，PAG)、羟胺（Hydroxylamine，HA)共孵育。免疫荧光检测hPDLCsCBS、CSE的表达，测定hPDLCs培养上清液中H2S表达水平，PCR和Western blotting检测成骨关键蛋白骨钙素(Osteocalcin，OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related Transcription Factor2，RUNX2)、Ⅰ型胶原(Collagen TypeⅠ，COL-Ⅰ)基因和蛋白水平的表达;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、茜素红染色检测早期和晚期阶段骨向分化能力。结合Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a探讨该通路在其中的调控作用。 结果: 1、原代培养细胞抗角蛋白染色阴性，抗波形蛋白染色阳性，提示为中胚层来源，即为hPDLCs。免疫荧光染色显示hPDLCs表达两种H2S合成酶CBS、CSE，并通过其合成H2S。10μmol/L、100μmol/L NaHS能略促进hPDLCs的增殖，而1000μmol/L NaHS在各个时间点均表现为抑制细胞增殖。与不同浓度NaHS孵育不同时间后，hPDLCs未出现形态改变。成骨能力检测发现，低或高浓度的H2S均抑制hPDLCs成骨蛋白的表达以及下调碱性磷酸酶的表达和矿化结节的形成。上调低浓度的H2S后可部分恢复hPDLCs成骨分化功能。 2、低或高浓度的H2S均抑制成骨蛋白及Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin、LEF1、CyclinD等的表达。Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a能上调Wnt/β-catenin信号通路关键分子的表达，H2S合成酶抑制剂PAG则下调Wnt/β-catenin信号通路关键指标的表达。成骨蛋白COL-Ⅰ和RUNX2、ALP表达和活性、矿化能力等成骨指标均有所上升。 结论: 1、人牙周膜细胞通过H2S合成酶CBS、CSE合成H2S。过高或过低浓度的H2S都将抑制细胞骨向分化。上调低浓度H2S后可部分恢复成骨分化功能。 2、人牙周膜细胞内源性合成的H2S处于合适浓度时，可激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进hPDLCs骨向分化。可望通过内源性H2S从而调控牙周组织的修复再生。