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慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是血管性痴呆(vascular dementia,VD)和阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)发生和发展的重要病理过程。随着我国老龄化进程加剧,VD和AD发病率逐年上升,二者共占我国所有痴呆类型的85%以上,已经成为一个重大的医疗和社会问题。寻找与研究以CCH为靶点的有效治疗方法可能对VD和AD的治疗提供新的思路。骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)是存在于骨髓中的单个核细胞群,包含多种干(祖)细胞及免疫调节细胞等有效成分。经静脉移植BMMNCs对急性脑梗死的积极疗效已被明确,相关的研究已在国外进入临床Ⅱ期阶段。本人前期就BMMNCs静脉移植对CCH大鼠模型的神经保护作用进行了研究,结果发现BMMNCs移植后亦能迁移至CCH大鼠模型脑部,通过促进血管新生作用显著改善其神经功能预后,为CCH的相关治疗提供了新的可能。目前BMMNCs移植治疗CCH的效率不高,主要原因为其经静脉移植后向缺血脑部迁移比例过低。血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性对BMMNCs向颅内迁移至关重要,适度增加BBB通透性可能增加BMMNCs向缺血大脑迁移的比例,进而增加其治疗CCH的疗效。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是脑内广泛表达的神经保护因子。VEGF能够增加BBB通透性,此过程是其促进血管新生必要的功能基础。既往研究提示,适量外源性VEGF可能在不影响脑组织结构和功能的前提下“适度”提高BBB通透性。本研究拟以CCH大鼠模型为研究对象,首先探讨不同剂量的外源性VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB的影响,寻找增加BBB通透性的最佳VEGF干预剂量;然后分析VEGF预处理对BMMNCs经静脉移植后在CCH大鼠模型体内定向迁移的影响,明确VEGF预处理能否增加BMMNCs向缺血脑部的迁移,以及是否对BMMNCs外周分布及外周免疫调节作用产生影响;最后以血管新生、神经发生、神经元凋亡及神经功能预后为指标,探讨VEGF预处理能否增加BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型的疗效。旨在通过上述研究找到提高BMMNCs移植治疗CHH效率的方法。第一部分VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB通透性的影响目的:探讨不同剂量的外源性VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB的影响,寻找增加BBB通透性的最佳VEGF干预剂量。方法:采用经典的双侧颈总动脉结扎术(2-vessel occlusion,2VO)制作CHH大鼠模型。本部分随机将大鼠为三组:假手术组(sham),模型组(2VO)和VEGF预处理组(VEGF)。VEGF组分为5个亚组,分别接受0.4μg/kg,0.6μg/kg,0.8μg/kg,1μg/kg和1.2μg/kg重组大鼠VEGF预处理。VEGF或生理盐水通过侧脑室注射的方法进行干预。以VEGF预处理后6 h作为时间点,通过干-湿重法及水迷宫测试观察各组大鼠脑含水量及神经功能变化,并以此为指标选取不引起脑水肿及神经功能恶化的最大VEGF剂量。然后通过检测各组大鼠脑部紧密结合蛋白ZO-1和claudin-5的表达(Western Blot技术)、ZO-1阳性血管数目(免疫荧光技术)及ALB和伊文氏蓝染料泄露情况(免疫荧光技术及分光光度计法),验证该剂量的VEGF对2VO大鼠BBB通透性的影响。结果:研究结果显示,与0.4μg/kg,0.6μg/kg和0.8μg/kg VEGF组相比,1μg/kg和1.2μg/kg VEGF预处理组大鼠脑含水量显著增高,神经功能显著恶化,差异有统计学意义(P<0.05)。因此本研究选取0.8μg/kg VEGF作为干预靶剂量,探讨了该剂量下2VO大鼠BBB通透性的变化,结果显示,与vehicle组相比,VEGF(0.8μg/kg)组大鼠脑部ZO-1和claudin-5蛋白含量显著降低,ZO-1阳性血管数目明显下调,ALB和伊文氏蓝染料泄露明显增加,差异有统计学意义。结论:0.8μg/kg VEGF预处理能够显著增加2VO大鼠BBB通透性,而不对其脑含水量及神经功能产生不良影响。第二部分VEGF预处理对BMMNCs移植后向CCH大鼠模型脑部迁移的影响目的:探讨VEGF预处理(0.8μg/kg)对BMMNCs静脉移植后在CCH大鼠模型体内迁移的影响,明确VEGF预处理能否增加BMMNCs向缺血脑部的迁移,以及能否对BMMNCs外周分布(肺脏)及其外周免疫调节功能产生影响。方法:采用2VO方法制作CCH大鼠模型。采用梯度离心法从eGFP转基因SD大鼠或普通SD大鼠股骨和髂骨中提取BMMNCs,以1.2×10~7 BMMNCs/kg的剂量,通过尾静脉注射进行移植。本部分随机将大鼠为6组:假手术+溶剂组(sham+vehicle),假手术+细胞移植组(sham+BMMNC),模型+溶剂组(2VO+vehicle),模型+细胞移植组(2VO+BMMNC),模型+VEGF预处理(0.8μg/kg)+细胞移植组(2VO+VEGF+BMMNC)和模型+SU5416预处理(4nM)+细胞移植组(2VO+SU5416+BMMNC)。各组大鼠均接受侧脑室注射(生理盐水、VEGF或SU5416)以及尾静脉注射(DMEM或BMMNCs单细胞悬液)操作。通过免疫荧光检测,观察细胞移植后6h各组大鼠大脑及肺脏e-GFP~+BMMNCs的数量,并通过ELISA技术,观察各组大鼠外周血IL-10、L-1β和TNF-α的表达情况。结果:研究结果显示,VEGF预处理(0.8μg/kg)显著增加了BMMNCs移植后向2VO大鼠缺血脑部的迁移数量,而VEGF受体阻断剂SU5416则显著降低了这一趋势。VEGF或SU5416预处理并不影响BMMNCs移植后向肺脏的定向迁移,也不影响BMMNCs移植引起的外周血IL-10、L-1β和TNF-α等免疫因子变化。结论:0.8μg/kg VEGF预处理能够显著增加BMMNCs移植后向缺血脑部的迁移量,而对BMMNCs向肺部的迁移以及外周免疫(IL-10、L-1β和TNF-α)没有影响。第三部分VEGF预处理对BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型疗效的影响目的:以血管新生、神经发生、神经元凋亡及神经功能预后为指标,探讨VEGF预处理(0.8μg/kg)对BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型疗效的影响。方法:采用2VO方法制作CCH大鼠模型。采用梯度离心法从SD大鼠股骨和髂骨中提取BMMNCs,以1.2×10~7 BMMNCs/kg的剂量,通过尾静脉注射进行移植。本部分将大鼠随机为6组:假手术+溶剂组(sham+vehicle),假手术+细胞移植组(sham+BMMNC),模型+溶剂组(2VO+vehicle),模型+细胞移植组(2VO+BMMNC),模型+VEGF预处理(0.8μg/kg)+细胞移植组(2VO+VEGF+BMMNC)和模型+SU5416预处理(4-nM)+细胞移植组(2VO+SU5416+BMMNC)。各组大鼠均接受侧脑室注射(生理盐水、VEGF或SU5416)以及尾静脉注射(DMEM或BMMNCs单细胞悬液)操作。通过水迷宫测试,评价各组大鼠神经功能变化情况;通过免疫荧光检测,观察各组大鼠脑部血管新生(Ki67阳性血管数量)、神经发生(SVZ区增殖细胞数量)以及神经元凋亡(FJB阳性细胞数量)的影响,综合探讨VEGF预处理对BMMNCs治疗CCH大鼠疗效的影响。结果:研究结果显示,VEGF预处理显著上调了BMMNCs移植介导的神经功能改善作用;与2VO+BMMNC组相比,2VO+VEGF+BMMNC组大鼠脑部BrdU~+/Lectin~+血管数量、SVZ区增殖细胞数量显著增加,FJB~+细胞数量显著减少,差异有统计学意义;SU5416预处理则显著削弱了BMMNCs移植介导的神经保护作用。结论:VEGF预处理(0.8μg/kg)能显著增加BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型的疗效。