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微生物产生的脂肽具有良好的表面活性和特殊的生物活性,在食品、化妆品、生物医药和环境等领域具有潜在的应用价值。然而,微生物脂肽的产量较低,分离纯化困难,在很大程度上限制了对其性质的研究和进一步的应用。本论文以Bacillus subtilisHSO121为出发菌株,经过优化发酵条件提高其脂肽的产量,建立了脂肽的分离纯化和室内制备方法,并对脂肽的结构和抗肿瘤活性进行了研究,主要结果如下。
(1)采用单次单因素和正交实验的方法,以菌浓、产物酸沉淀量和发酵液表面张力的降低值为评价参数,对Bacillus subtilis HSO121产脂肽的培养条件进行优化,在最优培养基下培养,脂肽粗品产量由原来的0.48 g/L提高到1.8 g/L。同时,建立了微生物脂肽的纯化方法,该方法包括常压柱色谱和高效液相色谱两步。利用这两步色谱技术从酸沉淀样品中制备得到8个化合物,通过薄层色谱和红外光谱定性得出八个化合物均为脂肽。该方法可用于制备几百毫克到克级的脂肽,是一种有效的分离纯化脂肽的方法。
(2)对8个脂肽化合物进行了结构鉴定。脂肽肽链部分氨基酸的组成通过氨基酸自动分析仪获得,连接顺序利用电喷雾离子化四极杆-飞行时间串联质谱进行解析;脂肪酸部分通过气相色谱/质谱进行分析。结果表明:脂肽1-8的分子量分别为:1007,1021,1021,1035,1035,1035,1063和1049。每个脂肽水解后含有相同的氨基酸组成,说明其分子量的差异由脂肪酸部分的链长和末端甲基的位置不同造成。其中,两个脂肽(7-8)结构中氨基酸的序列为N-Asp-Leu-Leu-Val-Glu-Leu-Leu-C;另外六个脂肽(1-6)的结构中氨基酸的序列为N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C。八个脂肽的混合物的脂肪酸部分由iso C12,iso C13,anteiso C13,iso C14,n C14,iso C15,anteiso C15,n C15,anteiso C16和anteiso C17 β-羟基脂肪酸组成。这些脂肽为β-羟基脂肪酸与肽部分键合形成的环状脂肽。
(3)从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HSO121的发酵液中分离到一个含C12脂肪酸的新的脂肽,该化合物为表面活性素的同系物。其脂肪酸部分通过电喷雾离子化四极杆-飞行时间串联质谱、气相色谱/质谱和核磁共振进行分析;肽链部分氨基酸组成通过柱前异硫氰酸苯酯衍生高效液相色谱法进行分析,连接顺序通过电喷雾离子化四极杆-飞行时间串联质谱得到解析,并将该化合物与C13表面活性素的串联质谱进行比较。结果表明,该化合物与表面活性素具有相同的肽骨架,不同之处位于脂肪酸部分,为isoC12β-羟基脂肪酸。表面张力测定结果表明该脂肽在10 mmol/L的磷酸缓冲盐(pH=8.0)中临界胶束浓度为6.27×10-5mol/L,临界胶束浓度时的表面张力为27.71 mN/m;溶血实验表明该化合物对2%的人红细胞的HC50为26.5 μmol/L。
(4)发现了一个分子量为1 049的新脂肽化合物,通过气相色谱/质谱、电喷雾离子化四极杆-飞行时间串联质谱和核磁共振进行其结构鉴定,并将其串联质谱与表面活性残基外,其它氨基酸及连接顺序均与表面活性素C15的相同,脂肪酸部分为isoC15和anteisoC15β-羟基脂肪酸的混合物。在磷酸盐缓冲液中的临界胶束浓度和对宫颈癌细胞的细胞毒性试验结果表明,该化合物具有比表面活性素C15更强的表面活性和较低的抗肿瘤活性,这一差异表明Glu残基在表面活性素类脂肽抗肿瘤活性中发挥着作用。
(5)选择了六株肿瘤细胞对脂肽化合物的抗肿瘤活性进行评价,肿瘤细胞对脂肽的敏感程度依次为:黑色素瘤细胞>乳腺癌细胞>肝癌细胞>宫颈癌细胞>口腔表皮癌细胞>胰腺癌细胞;脂肽对肿瘤细胞的细胞毒性依次为:C15脂肽>C14脂肽>C13脂肽。选择C15脂肽对乳腺癌细胞进一步研究发现脂肽对肿瘤细胞的细胞毒性表现为抑制作用和处杀作用两种方式。荧光染色和流式细胞仪检测结果表明脂肽具有诱导G1期肿瘤细胞凋亡的作用,同时发现脂肽导致细胞核染色质的断裂和皱缩。气相色谱/质谱分析表明脂肽通过影响肿瘤细胞的细胞膜脂肪酸的组成,可能是诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。脂肽的抗肿瘤作用与脂肽对肿瘤细胞膜的作用有关,还与脂肽的浓度以及脂肽和细胞膜的比例有关。