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背景:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤,发病率高,死亡率高。现阶段,结直肠癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗,包括手术切除肿瘤组织、化学治疗、放射治疗、生物治疗、免疫治疗等。但因结直肠癌病因复杂、恶性程度高、肿瘤生长迅速、侵袭能力强,故其5年生存率仍然不高。近年来寻找肿瘤特异性基因,通过RNA干扰技术沉默肿瘤特异性基因的表达,或研发针对肿瘤特异性基因的化学药物,成为肿瘤基因治疗的新方向。衣被蛋白复合体-亚基β2(coatomer protein complex,subunit beta2,beta prime,COPB2),又称β’-COPB2(beta’-COP),主要分布在内质网、高尔基体等部位,参与细胞内及细胞间物质转运。近年来研究发现,前列腺癌PC3细胞中COPB2呈高表达状态,并与肿瘤细胞的增殖密切相关。常山酮是中药常山的衍生物,早期主要作为广谱抗球虫药物用于禽类球虫病的预防和治疗。研究发现,常山酮在抗肿瘤方面具有较强的应用价值,对肝癌、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞或荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用。目的:本研究将检测结直肠癌RKO、HCT116细胞株及结直肠癌组织标本中COPB2的表达情况;阐明COPB2基因在细胞增殖、凋亡中的作用并探索其分子机制;研究常山酮对RKO及HCT116细胞增殖的影响;探讨COPB2基因沉默是否影响结直肠癌细胞株对常山酮的敏感性,为结直肠癌基因治疗及中西医结合治疗提供基础实验数据。方法:1.RT-q PCR及免疫组化检测结直肠癌细胞株及临床组织标本中COPB2的表达情况;在多种结直肠癌细胞株中筛选高表达细胞。2.慢病毒包装的si RNA干扰RKO及HCT116细胞中COPB2基因的表达。3.MTT、CCK8、Celigo细胞计数、Brd U及流式细胞仪、Western Blot检测COPB2基因沉默对RKO及HCT116细胞增殖及细胞周期的影响。4.克隆形成实验检测COPB2基因沉默对RKO及HCT116细胞克隆形成能力的影响。5.Annexin V-APC单染流式细胞仪检测COPB2基因沉默对RKO及HCT116细胞凋亡的影响。6.Caspase-Glo?3/7 Assay荧光素底物发光实验检测COPB2基因沉默对RKO及HCT116细胞中Caspase3/7活性的影响。7.Path Scan筛选凋亡通路关键信号分子。8.Western Blot分析JNK/c-Jun信号通路在COPB2基因沉默诱导RKO及HCT116细胞凋亡中的作用。9.不同浓度常山酮与RKO及HCT116细胞共育,MTT及CCK8检测常山酮对肿瘤细胞增殖的影响。10.不同浓度常山酮与RKO、HCT116亲本细胞及相应的COPB2基因沉默细胞共育,MTT及CCK8检测、比较分析COPB2基因沉默后肿瘤细胞对常山酮敏感性的影响。11.流式细胞仪检测常山酮对RKO、HCT116亲本细胞及相应的COPB2基因沉默细胞细胞周期的影响。结果:1.结直肠癌细胞株RKO、SW480、SW620、HCT116、DLD1、HT-29中COPB2基因均呈高表达状态,选择RKO及HCT116细胞为后续实验细胞。2.免疫组化分析结直肠癌患者癌组织及癌旁组织中COPB2表达情况,结果显示,癌组织中COPB2表达明显高于癌旁组织(P<0.001);患者临床病理资料分析显示,III期和IV期癌组织中,COPB2的表达明显高于I期和II期(P<0.01)。3.m RNA水平及蛋白水平检测结果显示,慢病毒介导的si RNA能够显著抑制COPB2在RKO及HCT116细胞中的表达(P<0.01)。4.COPB2基因沉默,能显著抑制RKO及HCT116细胞增殖及克隆形成能力(P<0.001,P<0.01或P<0.05);可诱导RKO细胞发生G1期阻滞,HCT116细胞发生S期阻滞(P<0.01);Western Blot分析细胞周期相关蛋白,显示COPB2基因沉默后,RKO及HCT116细胞中P16蛋白及P21蛋白表达水平显著增加(P<0.01或P<0.05),Cyclin A蛋白表达降低(P<0.01)。5.Annexin V-APC单染分析COPB2基因沉默后各组细胞的凋亡情况,结果显示RKO细胞中,亲本细胞、空质粒对照细胞及COPB2沉默细胞凋亡率分别为3.17%±0.08、3.45%±0.25、5.99%±0.09;HCT116细胞中,以上各组细胞凋亡率分别为3.89%±0.26、4.07%±0.12、9.15%±0.18,COPB2沉默后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。Caspase-Glo?3/7 Assay荧光素底物发光实验检测Caspase3/7活性结果显示,COPB2基因敲除后,两种细胞中Caspase3/7的活化率均明显增加(P<0.01);Western Blot结果显示,COPB2基因沉默组细胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05),促凋亡蛋白Bax表达明显增高(P<0.01)。6.Path Scan筛选结果显示,COPB2基因沉默后RKO细胞中Stress and Apoptosis信号通路中Bad,P53,SAPK/JNK等蛋白表达在亲本细胞组及COPB2基因沉默细胞组间存在差异(P<0.01或P<0.05),而这些蛋白均为JNK/c-Jun信号通路中的关键分子,因此进一步探讨JNK/c-Jun信号通路在COPB2基因沉默诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用。Western Blot结果显示,COPB2基因沉默后,与对照组相比JNK、JUN蛋白表达增加(P<0.01或P<0.05),同时JNK/c-Jun信号通路中P53、Bad、Bax、Caspase3表达均增加(P<0.01或P<0.05)。7.常山酮以15.63μg/ml~500μg/ml的浓度梯度分别作用于RKO及HCT116细胞时,对肿瘤细胞的增殖均具有抑制作用(P<0.01或P<0.05)。8.COPB2基因沉默后,结直肠癌RKO及HCT116细胞对常山酮增殖抑制作用的敏感性增高(P<0.01或P<0.05)。9.COPB2基因沉默后,常山酮更易引起RKO细胞发生S期阻滞(P<0.01)、HCT116细胞发生G1期阻滞(P<0.05)。结论:1.结直肠癌组织中COPB2呈高表达状态,且与患者临床病理分期相关;2.COPB2基因在结直肠癌细胞RKO及HCT116中高表达,COPB2基因沉默可通过调节细胞周期相关蛋白引起细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞增殖;3.COPB2基因沉默可通过JNK/c-Jun信号通路诱导结直肠肿瘤细胞凋亡;4.常山酮对结直肠肿瘤细胞RKO及HCT116具有增殖抑制作用;COPB2基因沉默可提高肿瘤细胞对常山酮的敏感性。