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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一,因其早期诊断困难、易复发、预后差,病情仍得不到有效控制。目前肝癌的主要治疗手段仍然是以手术切除为主的综合治疗模式,缺乏有效的药物靶点。深入研究肝癌发生发展机制,寻求肝癌早期诊断、预后与治疗的潜在分子靶点,成为肝癌研究的重要方向。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学的发展,人们对非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)的研究不断深入,其中,环状RNA(circular RNA,circ RNA)作为一种广泛存在于真核生物转录组、具有组织细胞特异性的内源性非编码nc RNA逐渐被大家认识。circ RNA可作为微小RNA(micro RNA,mi RNA)的海绵,通过吸附mi RNA,抑制mi RNA结合靶m RNA进而参与肿瘤发生发展。然而,肝癌进展过程中circ RNA表达谱变化及其功能尚不清楚。本研究中我们使用二代高通量测序技术分析10例肝癌病人癌组织及其相应癌旁组织的circ RNA表达变化差异,并以circ ADAMTS13(来自ADAMTS13基因第13和第14外显子的环状RNA分子)为代表,进一步探索circ RNA在肝癌中的功能及临床价值。目的1、筛选肝癌病人癌组织及其配对癌旁组织中差异表达circ RNA,阐明circ ADAMTS13与肝癌病人各项临床病理特征的相关性,评价其对肝癌病人预后的预测价值;2、阐明circ ADAMTS13在肝癌发生发展中的生物学功能,筛选并验证可能与circ ADAMTS13互作的mi RNA,探讨circ ADAMTS13靶向mi RNA在调控肝癌发生发展中的分子机制,为circ ADAMTS13作为肝癌治疗潜在的靶点提供参考。方法1、收集10对肝癌病人的癌组织和癌旁组织提取总RNA,进行二代高通量测序,结合生物信息学,分析各样本中的circ RNA表达情况,筛选肝癌组织及其对应的癌旁组织中差异表达的circ RNA;2、收集102例经手术切除且病理鉴定证实的肝癌组织样本,实时定量PCR(Q-PCR)检测circ ADAMTS13在肝癌组织中表达,SPSS软件统计并分析circ ADAMTS13的表达水平与肝癌临床特征的相关性以及其对肝癌预后的影响;3、RNase R消化实验,放线菌素D转录抑制实验验证circ ADAMTS13的稳定性。构建慢病毒载体感染的稳定过表达circ ADAMTS13的细胞模型,CCK8与克隆形成实验检测过表达circ ADAMTS13对肝癌细胞增殖的影响,细胞流式技术检测其对肝癌细胞凋亡的影响;4、三种生物信息学工具(Targetscan,RNAhybir和Ciranda)共同预测circ ADAMT S13可能参与的circ RNA/mi RNAs信号网络,筛选可能与circ ADAMTS13结合的mi RNA,荧光素酶报告基因检测系统验证与circ ADAMTS13相互作用的靶mi RNA。克隆形成实验进一步证实mi RNA的表达对circ ADAMTS13功能的影响。结果1、环状RNA测序共鉴定到92204个环状RNA分子,其中大部分来源于外显子,长度大多在100-450个核苷酸左右,42个环状RNA在肝癌组织和癌旁组织中表达差异具有统计学意义(改变倍数≥2.0或≤0.5,P<0.05),我们筛选出在测序过程中环化位点被鉴定到频率最高的3种环状RNA(circ ADAMTS13、circ DPF3、circ CASP8AP2),扩大26例样本进一步验证,circ ADAMTS13、circ DPF3在肝癌组织中显著低表达与测序结果相符;2、肝癌组织中circ ADAMTS13的低表达与较大的肿瘤直径和较晚的肿瘤BCLC分期相关。Kaplan-Meier生存分析表明低表达circ ADAMTS13的病人具有更短的的无瘤生存时间以及总体生存时间;3、稳定性实验证实circ ADAMTS13不受RNase R降解,比起其线性RNA更加稳定。在Hep G2与PLC/PRF/5细胞株中过表达circ ADAMTS13能够抑制肝癌细胞的增殖,并且促进肝癌细胞凋亡;4、荧光素酶报告系统结果显示circ ADAMTS13能与mi R-484相结合,回复性实验进一步证实过表达mi R-484可显著逆转circ ADAMTS13对肝癌细胞的抑制作用。结论Circ ADAMTS13低表达与肝癌病人术后较差的预后相关,可作为预测肝癌预后潜在的肿瘤标记物;Circ ADAMTS13可通过海绵作用结合促癌因子mi R-484抑制肝癌细胞的增殖,可作为肝癌治疗的潜在靶点。