骨缺损常因肿瘤切除、骨折、感染或者骨退化疾病引起,其治疗耗费巨大的社会经济资源。尽管临床上广泛使用自体骨移植、异体骨移植等方法来解决缺失骨的替代问题,然而组织的可用性,捐赠部位的发病率或者免疫排斥反应等问题依然极大限制了这些技术在临床的广泛使用。纯钛和掺杂钒或镍等的钛合金具有非常卓越的生物相容性和较强的抗腐蚀性,展现出了它们作为骨替代物—承重金属植入体的优越性。然而钛或钛合金植入体与骨组织的机械不匹配导致了“应力屏蔽”效应,加速了骨吸收,这就增加了植入体松动的风险。为最大限度的模拟自体骨,植入体可以采用与松质骨结构相近的多孔形式,为营养物运输和代谢产物的传送提供良好的多孔通道。然而以钛为基底的材料具有生物惰性,很容易与自然骨以“机械铆合”的形式结合而并非形成所希望的化学键的方式结合,这就会导致钛或钛合金植入体的骨整合不完全。目前这仍然是一项临床的巨大挑战,骨整合不完全会导致早期的固定不稳,长期的植入体稳定性降低,尤其是在骨质疏松病人体内。因此,寻找新的加速钛或钛合金植入体骨整合的方法,以提高修复效能、改善骨缺损,对临床应用意义重大。国内外大量研究证实脉冲电磁场(PEMF)作为一种可供选择的非侵入式物理治疗手段,对一系列的骨相关疾病能产生令人满意的治疗效果,例如骨愈合、骨不连和骨关节炎等。一些体内的实验研究也证明了PEMF可以抑制骨钙丢失,改善骨质疏松动物的骨质量。关于PEMF改善骨质疏松的效能也被一些临床研究所证实。PEMF可有效促进体外成骨细胞的增殖和矿化,并且抑制破骨细胞的生成。尽管PEMF展现出了如此众多积极的效应,但是关于PEMF是否可以促进骨缺损动物体内的骨长入多孔钛合金(p Ti)植入体,加速p Ti的骨整合的问题,依然悬而未解。因此,在本研究中我们提出了“PEMF协同p Ti修复骨缺损”的新理念和新思路,旨在系统性地探索PEMF对p Ti在体内和体外骨形成的生物效能方面的潜在影响。首先,我们进行了体外较优磁场参数的筛选,利用筛选出的参数进行了体外PEMF对p Ti上成骨细胞活性和功能的影响及潜在分子机制的探究。其次,通过构建兔长骨骨缺损实验动物模型,制备低弹性模量的p Ti,采用Micro-CT、形态学、形态计量学等参数系统性的评估了PEMF协同p Ti对长骨骨缺损的修复效果。此外我们对PEMF协同p Ti对体内骨生成的分子作用机制也进行了进一步探究。本研究有望为临床上提高p Ti的修复效率和修复质量提供新策略,为加速p Ti的骨整合,促进植入体的早期固定和增加其在体内的长期稳定性提供重要的实验依据。整个研究主要分为以下四部分:第一部分:p Ti植入材料的制备及PEMF促成骨细胞活性的参数筛选背景:钛合金属于致密材料其弹性模量远高于松质骨,因此,易导致植入体和其周围自然骨形成“应力屏蔽”,从而加速骨吸收,提高体内植入体的松动风险。将钛合金制作成多孔结构,不仅与松质骨在结构上近似,而且为骨代谢、骨长入和营养物质的运输提供了适宜的孔径通道,利于骨整合。p Ti的弹性模量主要由孔径大小、孔隙率等特性决定。而将p Ti根据临床病患需求制造成具有相应力学特性和结构特点的植入体,对结构特性的高度控制,则需要电子束熔融技术的帮助。大量的体外、体内实验均证实了PEMF影响骨形成,但是所采用PEMF的频率、场强和刺激加载--时长等参数不同,其对骨骼细胞的作用效果不同。探究优化的促成骨细胞活性组合参数,是后续研究PEMF促骨形成的信号转导机制的重要前提。方法:用CAD软件设计p Ti,直接导入Electron beam melting(EBM)设备,通过3D打印技术,制作p Ti植入体,通过扫描电镜(SEM)观察,进一步对p Ti的形貌进行观察与分析。根据细胞增殖活性指标,分别对PEMF单纯作用于成骨细胞的脉冲刺激强度、加载刺激时长参数进行较优的筛选。结果:EBM制作出的圆柱和圆片两种p Ti结构特性均符合要求。频率15 Hz的PEMF采用强度为20 Gs(2 m T),作用时长2 h/d的磁场组合参数促进体外成骨细胞活性。结论:EBM是一种高效且可高度控制材料结构特性的制造方法。所筛选出的磁场组合参数与之前课题组进行的体内研究结果相一致。第二部分:PEMF体外促骨形成的影响和机制研究背景:成骨细胞在骨形成过程中行使主要功能,参与骨基质的分泌和钙化。其对PEMF的响应,可以改善骨自身的修复能力。有众多学者认为PEMF对骨形成的改善取决于骨骼细胞接受刺激作用所处的阶段,如增殖阶段、分化阶段等。但是目前仍然缺少对成骨细胞处于增殖或成熟分化等阶段时接受PEMF刺激所诱发的表型进行系统的研究证实,缺少对处于不同细胞阶段的成骨细胞接受PEMF刺激后所诱发表型的潜在信号转导机制的系统研究。方法:通过CCK-8检测以及细胞骨架的免疫荧光染色对PEMF刺激处于增殖期的成骨细胞的活性进行评估,通过q RT-PCR和Western Blot对PEMF调控细胞周期的潜在经典Wnt信号转导通路进行探究;通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色、q RT-PCR和Western Blot等常用实验室技术手段对PEMF作用于分化阶段的成骨细胞的影响以及信号转导机制进行探究。结果:在成骨细胞增殖阶段,PEMF上调经典Wnt信号通路的基因表达和蛋白分泌、表达,以增强其下游细胞周期相关基因Ccnd1和Ccne1的表达,PEMF组成骨细胞增殖能力增强,但是ALP基因表达受到抑制;在成骨细胞分化阶段,PEMF组ALP染色深染,矿化面积以及钙化结节数量增加,成骨相关基因Runx2、OCN、COL1上调,经典Wnt信号通路的基因表达和蛋白转录一致均为上调,进而调控其下游成骨相关的OCN、Runx2等基因表达和蛋白分泌、表达。结论:揭示出经典Wnt信号转导通路参与了PEMF对成骨细胞生物学行为的调控。第三部分:体外PEMF对p Ti上骨形成的影响及机制研究背景:p Ti具有出色的生物相容性和耐腐蚀性,加上出众的结构特性,使其成为理想的骨替代内植入体。然而,PEMF对p Ti植入体骨生成和骨整合的影响一直尚未明确。因此,我们系统地研究了PEMF对p Ti上成骨细胞生物学行为的影响。方法:采用DAPI染色观测早期细胞黏附,通过SEM和CLSM观察p Ti上成骨细胞形态,采用CCK-8检测细胞增殖活性,通过q RT-PCR和Wstern Blot探究经典Wnt信号通路的表达。结果:PEMF组成骨细胞早期黏附能力增强,p Ti表面黏附数量增多;细胞骨架发育良好,其荧光染色深染;成骨细胞微丝增多,应力纤维增粗;电镜结果显示PEMF组成骨细胞表面出现更多的褶皱,板状和丝状伪足均增多。在基因表达方面,PEMF组显著提高了成骨相关基因Runx2、Osx和COL1的表达,同时增强了经典Wnt信号通路的表达,包括Wnt1,Lrp6和β-catenin。蛋白分泌检测结果与基因表达相一致,充分印证了PEMF可以增强p Ti植入体上成骨细胞活性。结论:PEMF有利于p Ti内部成骨细胞进入黏附、矿化,揭示出PEMF在p Ti上调控成骨生成和新骨形成可能的主要机制为激活Wnt/β-catenin信号通路。第四部分:骨缺损动物模型体内PEMF对p Ti骨整合的影响和机制研究背景:p Ti的弹性模量虽然有较大改善,但是目前仍然与自然骨组织之间存在机械不匹配问题。由于p Ti的生物惰性,很容易以“机械铆合”形式与周围骨结合,而并非所期望的化学键结合方式。骨整合不理想使早期的p Ti固定得不到保证,增加了病患体内植入体松动的风险。因此,研发新技术加速p Ti的骨整合,提高骨修复效率和质量,具有重要临床意义。方法:通过外科手术方法构建兔长骨骨缺损模型。通过Micro-CT、形态学定量分析等系统性评估PEMF对p Ti修复长骨骨缺损的促进作用效果。采用q RT-PCR技术探究体内PEMF对p Ti内骨生成作用的潜在分子转导机制。结果:三维Micro-CT数据显示PEMF刺激6周组和12周组的p Ti植入体内部新骨长入良好,并且长入植入体内部的新骨骨量增多;二维的冠状面和矢状面切片数据进一步证实了PEMF促进更多的新骨长入p Ti内部。定量统计结果显示PEMF组BV/TV显著提高,而BS/BV和Tb.Sp显著降低,同时无论6周组还是12周组的Tb.N和Tb.Th均为高水平表达。组织形态学定量分析证实PEMF促进更多的新小梁骨长入骨缺损区域的p Ti植入体孔径内。荧光双标分析证实在骨缺损区域PEMF组骨形成速率增加,MAR、MS/BS和BFR/BS均较对照组显著增强。接受PEMF刺激的6周组和12周组均激活了经典Wnt信号通路,包括Wnt1、Lrp6和β-catenin,成骨相关基因Runx2、BMP2和OCN的m RNA表达水平全部上调。结论:PEMF可以促进新骨长入p Ti内部,改善p Ti的骨整合效果,利于增强p Ti在体内的长期稳定性,经典Wnt信号通路参与了该过程。PEMF有望成为临床上辅助p Ti治疗骨缺损的生物物理方法。