背景结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的传染性疾病。全球约1/3的人口感染MTB,其中约5-10%罹患活动性结核病,每年约900万例新增活动性肺结核报告。近年来,由于耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)与MTB伴发感染,使结核病成为死亡人数最高的传染病。传统结核病的治疗仍以基于抗生素的化疗为主,但由于疗程长、副作用大、以及耐药性等问题,导致结核病患者久治不愈、治疗效果欠佳。MTB属于胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用,抗结核感染的免疫机制主要是细胞免疫,作用最关键的是特异性CD4+Th和CD8+CTL。T细胞过继免疫治疗可以作为对结核免疫缺陷患者和耐药患者有效的治疗方法。T细胞过继免疫治疗是体外培养、扩增、并利用抗原特异T细胞表面受体(TCR)基因修饰T细胞,赋予T细胞抗原识别特异性,回输体内从而使机体获得大量效应T细胞,以发挥清除MTB作用。本研究所已证实MTB抗原特异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞在具有良好的抗结核活性。然而,自体T细胞过继免疫治疗适用范围窄,需针对病例个体进行结核特异性抗原刺激T细胞、筛选抗原特异T细胞,建立并筛选T细胞克隆、抗原特异性TCR构建、基因修饰T细胞等过程,其筛选的TCR基因不具有广泛适用性,仅针对个体适用,且周期长。有研究表明流感病毒、人类疱疹病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV)等病毒感染的病例间可观察到TCR的偏好取用,即限制性取用特定α链可变区基因(Vα)、p链可变区基因(Vβ)或互补决定区3(CDR3)区序列,具有保守的TCR基因。这些保守TCR基因具有高活性及敏感性,对抑制病毒复制起到重要作用。在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,分别与负载灭活H37Rv菌株的DC共培养,检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖与IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌水平,TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌水平,及其对靶细胞的杀伤作用,证实含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰的T细胞具有一定的抗结核活性。目的找到结核特异CDR3保守序列,构建含保守序列的TCR,研究其修饰患者T细胞的体外抗结核活性,为下一步动物实验奠定基础,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗提供依据。方法1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列①采用淋巴细胞分离液分离结核患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC);②分别磁珠分选出CD4+、CD8+T细胞,提取CD4+和CD8+T细胞mRNA,逆转录为cDNA；③CDR3谱型分析检测CDR3谱型,并选择在CD4+、CD8+T细胞中,呈单克隆扩增的抗原特异TCR α、β基因家族测序分析,分析病例间结核特异CDR3保守序列及优势表达的V基因家族、J基因片段；④利用CDR3谱型复杂性评分系统对结核患者和健康志愿者进行评分,并比较差异；⑤利用相对复杂性评分系统分析结核患者间CDR3区基因多样性差异。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的重组逆转录病毒表达载体①获取高频使用V基因片段,以及C基因片段的序列,构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,分析TCR a链和β链排列组合而成的异二聚体结构的稳定性,确定需构建的TCR基因：②根据人α链和β链基因家族可变区(variable region, V)和恒定区(constant region, C)基因序列设计引物,扩增含结核特异CDR3保守序列的TCR的α链和p链全长基因；③采用本实验室已经构建好的最小突变C区(其中C区9个氨基酸位点替换)替换α链和β链全长基因的C区：④利用重组PCR技术,将已最小突变TCRα链和β链基因通过自剪切多肽2A连接,并克隆至pGEM-T载体测序鉴定；⑤将测序正确的TCR全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；⑥采用磷酸钙转染法,包装逆转录病毒,超速离心法浓缩病毒；⑦重组病毒转染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染性滴度,计算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3.含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰T细胞的抗结核活性IL-2和抗CD3单抗活化T细胞后,以MOI=10将重组病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP转染T细胞,通过流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比。按一定效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰T细胞与负载灭活H37Rv菌株的DC混合培养,以未转染和空载体转染的T细胞为阴性对照,以鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为非特异性抗原对照；酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测一定时间TCR基因修饰CD4+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平,利用WST-8法检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖：ELISA检测一定时间TCR基因修饰CD8+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平,利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)技术,检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载MTB的DC的杀伤活性。4.统计学分析利用配对T检验方法比较健康志愿者与结核患者CD4+、CD8+T细胞亚群的CDR3谱型复杂性评分：利用单因素方差分析比较3组结核患者病例组组间相对复杂性评分；利用多个独立样本非参数检验评估患者年龄、型别、卡介苗接种史、结核菌素皮肤试验、结核病史或接触史、吸烟状况、结核病种类间差异；利用斯皮尔曼相关性分析检测相对复杂性评分和疾病严重程度以及其他临床指标的相关性。CD4+T、CD8+T细胞的细胞因子分泌水平的差异、CD8+T杀伤率应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch校正,各组间两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法,采用析因设计资料的方差分析CD4+T细胞增殖水平。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据分析。结果1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列检测86例结核患者CDR3谱型,对单克隆增生T细胞进行TCR基因测序,结果显示：86例病例中V基因片段高频使用Va7 (43.02%). Va9 (48.84%)、Vα17 (50%)、Vα32(41.86%)、Vβ19(86.5%)、Vβ24 (62.79%)基因家族。分析其CDR3区基因序列,结果显示：J基因片段中Jα34, Jα57, Jβ2-1出现频率较高；Vα链和Vβ链CDR3区存在保守序列,其中TCR　Vα链CDR3区中存在GGGGNKLI. GGGNEQYF. APDTGSGAF保守序列,TCR　Vβ链中存在GGGNKLI、TNKUI、 SADKLI保守序列。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的逆转录病毒表达载体从GeneBank中获取高频使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列,将CDR3保守序列与V、J、C基因片段拼接成全长α、β链基因序列,并对α、β链随机搭配组合形成的TCR进行构象预测,选出稳定性较佳的TCR Vβ19. Va7双链。成功扩增出经最小突变的含有结核特异CDR3保守序列的TCRβ及a链全长基因,经TA克隆后测序,Vβ19、Va7基因序列与预期的V区序列完全一致,C区的基因序列与预期相符。利用自剪切多肽2A,通过重组PCR,扩增出T细胞的hVp 19mCβ-2 A-hVa7mC融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达载体pMX-hVp19mCβ-2A-hVa7mCa-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将其与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-29 3,48h后取病毒上清,浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,检测病毒感染滴度。3.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD4+T细胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h,ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-y分泌水平显著高于UnTd+DC组(P<0.001),略高于另外三组但差异不显著；患者2的Td+MTB组IFN-y分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,2例患者Td+MTB组的TNF-a分泌水平均显著高于其他各组(P<0.001)。按E：T=15,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h, ELISA检测上清中IL-4的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IL-4分泌水平显著低于UnTd+DC组、EmTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.001),略低于UnTd+MTB组但差异不显著；患者2的Td+MTB组IL-4分泌水平显著低于其他各组(P<0.05)。②检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,测定第7天各组CD4+T细胞的增殖水平。结果显示,患者1的Td+MTB组增殖水平显著高于UnTd+DC组和UnTd+MTB组(P<0.05),略高于其它两组但差异不显著；患者2各组间增殖水平无统计学差异(P>0.05),但Td+MTB组T细胞增殖水平略高于其它各组。4.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h, ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于Td+OVA组(P<0.05),略高于其它三组但差异不显著；患者2的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含保守CDR3序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显著；患者2的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中GrB的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组GrB分泌水平显著高于其他各组(P<0.001);患者2的Td+MTB组GrB分泌水平显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显著。②检测TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤活性按E：T=30,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,检测各组CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用。结果显示,患者1的Td+MTB组的杀伤率显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和EmTd+MTB组(P<0.05),略高于Td+OVA组但差异不显著；患者2的Td+MTB组的杀伤率显著高于其他各组(P<0.05)。结论在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,证实其具有一定的体外抗结核活性,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗奠定了基础。