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特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一类间质性纤维化肺疾病,病因不明,早期病理学表现为弥漫性肺泡炎,后期表现为大量的成纤维细胞增殖、分化,细胞外基质沉积并取代正常肺组织,预后差,死亡率高,IPF的发病机制还未完全阐明,且没有有效治疗措施。现代研究表明,低活性自噬已成为肺纤维化的一个重要发病原因,在肺纤维化的发生过程中发挥着重要作用,PTEN/m TOR信号通路是IPF中细胞自噬的主要调控通路。IPF按其症状描述对应传统医学“肺痿”、“肺痹”等病种,本课题组在长期的实验研究中发现,气虚血瘀是IPF的重要病机,采用补阳还五汤这一益气活血代表方干预IPF疗效显著。因次我们提出了假设,补阳还五汤的干预作用可能是基于自噬相关的PTEN/m TOR通路实现的,本研究从“细胞自噬”出发,以PTEN/m TOR信号通路为调控路径,继续探索补阳还五汤对IPF干预过程中的作用机制,为IPF的治疗提供新的方法。实验共分为3部分:1.实验一补阳还五汤对博来霉素所致肺纤维化小鼠肺组织形态学的影响目的:观察博来霉素所致纤维化小鼠肺组织形态学变化及补阳还五汤对其干预影响。方法:本实验选取一次性气管内滴注博来霉素水溶液的方法进行实验纤维化小鼠模型的建立,实验组予高、中、低剂量的补阳还五汤进行干预,阳性对照组予以强的松,于造模后第7、14、28天分批处死小鼠,分离肺组织。在实验进行过程中观测小鼠的一般情况(包括精神、摄食、皮毛、重量等),取肺组织行HE及Masson染色,进行肺泡炎及肺纤维化程度Szapiel评分,探讨补阳还五汤对肺纤维化的干预作用。结果:1.小鼠一般情况及肺组织肉眼形态学:假手术组各时间点小鼠生长状况良好,模型组小鼠精神萎靡,动作迟缓,饮食摄水减少,体重下降,脱毛,皮毛枯槁无光泽,呼吸急促可闻及喘鸣音,小便量增多,大便质稀,肛周见残留粪便,肺组织肉眼形态差。其他给药组小鼠一般情况及肺组织肉眼形态均优于模型组。2.补阳还五汤对小鼠肺泡炎和纤维化程度的影响:模型组与假手术组相较,在7,14,28天3个时间点里肺泡炎与肺纤维化程度明显升高,具有明显差异(P<0.01)。在7,14,28天3个时间点和模型组相较,补阳还五汤各给药组及强的松组积分下降明显(P<0.05)。补阳还五汤高剂量组和其他各给药组相比在7,14,28天3个时间点积分均有所下降(P<0.05)。其他各组间相比无意义。结论:1.博来霉素气管注射可成功复制小鼠特发性肺纤维化模型。2.补阳还五汤可以改善博来霉素所致肺纤维化小鼠一般生命状况、肺组织形态,对特发性肺纤维化前期肺泡炎阶段及后期纤维化阶段均有一定的治疗作用,治疗效果以高剂量组最优。2.实验二补阳还五汤对博来霉素所致肺纤维化小鼠PTEN/m TOR信号通路的调节作用目的:探讨PTEN/m TOR信号通路在特发性肺纤维化小鼠发病过程中的作用机制,及补阳还五汤对其调控作用。方法:模型制备及分组、给药、取材同实验一。蛋白质免疫印记法(Western blot)检测小鼠肺组织PTEN蛋白、m TOR蛋白、核糖体S6蛋白、磷酸化核糖体S6蛋白表达,免疫组化法(SABC法)检测小鼠肺组织m TOR蛋白、核糖体S6蛋白表达。结果:1.补阳还五汤对小鼠肺组织PTEN蛋白表达的影响:模型组肺组织PTEN表达水平在7,14,28天三个时间点内较假手术组相比明显升高(P<0.01)。补阳还五汤高、中、低剂量组及强的松组PTEN表达水平较相同时间点的模型组显著下调(P<0.01),补阳还五汤中、低剂量组和强的松组PTEN表达水平在14天时均低于同时间点模型组(P<0.05)。补阳还五汤高剂量组PTEN表达与同时间内强的松组,补阳还五汤中、低剂量组相比在三个时间点下降明显(P<0.01)。补阳还五汤中、低剂量组与强的松组在三个时间点内相比差异无统计学意义(P>0.05)。2.补阳还五汤对小鼠肺组织m TOR表达的影响:(1)蛋白质免疫印记法:模型组小鼠肺组织中m TOR表达水平在7,14,28天三个时间点内与假手术组相比明显增高(P<0.01)。与同时间点模型组相比,补阳还五汤高、中、低剂量组和强的松组肺组织m TOR表达水平有不同程度的降低(P<0.01)。补阳还五汤高剂量组在三个时间点较同时间点强的松组,补阳还五汤中、低剂量组相比下降明显(P<0.01)。补阳还五汤中、低剂量组与强的松组各时间点相比差异无统计学意义(P>0.05)。(2)免疫组化法:模型组肺组织中m TOR表达水平在7,14,28天三个时间点较假手术组明显增高(P<0.01)。补阳还五汤中、低剂量组和强的松组m TOR表达水平在28天时较模型组有所降低(P<0.05),其他时间点各给药组m TOR表达水平较同时间模型组明显降低(P<0.01)。与其他给药组相比,补阳还五汤高剂量组m TOR表达在第7天显著下降(P<0.01),补阳还五汤高剂量组和强的松组相比14天时明显下降(P<0.05),和中、低剂量组比较14天时下降显著(P<0.01),补阳还五汤高剂量组28天时和同时间点强的松组,补阳还五汤中、低剂量组比较有所下降(P<0.05)。补阳还五汤中、低剂量组在各时间点和强的松组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3.补阳还五汤对小鼠肺组织S6表达的影响:(1)蛋白质免疫印记法:与假手术组相比,模型组在7,14,28天肺组织中S6表达水平明显增高(P<0.01)。补阳还五汤各给药组和强的松组S6表达水平与同时间点模型组相比有不同程度的降低(P<0.01)。补阳还五汤高剂量组S6表达水平在7天时和强的松组及补阳还五汤中、低剂量组比较下降明显(P<0.01),补阳还五汤高剂量组14天时与强的松组,补阳还五汤低剂量组相比下降明显(P<0.01),与补阳还五汤中剂量组相比无意义(P>0.05),补阳还五汤高剂量组28天时与强的松组相比下降明显(P<0.05),补阳还五汤中剂量组14天时与强的松组(P<0.01)、补阳还五汤低剂量组(P<0.05)相比下降明显,其余各组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(2)免疫组化法:与假手术组相比,模型组在7,14,28天肺组织中S6表达水平明显增高(P<0.01)。7,28天补阳还五汤各给药组和强的松组S6表达水平与同时间点模型组相比降低明显(P<0.01),14天时补阳还五汤高剂量组和模型组相比降低(P<0.05),中、低剂量组与模型组相比降低明显(P<0.01)。7天时补阳还五汤高剂量组S6表达较强的松组及补阳还五汤中、低剂量组组下降明显(P<0.01),14天时补阳还五汤高剂量组S6表达较补阳还五汤中、低剂量组有所下降(P<0.05),与强的松组相比无意义(P>0.05),补阳还五汤高剂量组28天时和强的松组相比下降明显(P=0.01),与中、低剂量组比较下降明显(P<0.01),其他各组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.补阳还五汤对小鼠肺组织p-S6表达的影响:与假手术组相比,模型组在7,14,28天肺组织中p-S6表达水平明显增高(P<0.01)。补阳还五汤三个给药组及强的松组p-S6表达水平与同时间点模型组相比均有所降低(P<0.01)。补阳还五汤高剂量组7天时与强的松组、补阳还五汤中剂量组相比下降(P<0.05),与补阳还五汤低剂量组相比下降明显(P<0.01),14天、28天时补阳还五汤高剂量组较强的松组及补阳还五汤中、低剂量组比较下降明显(P<0.05),其他各组之间相比p-S6表达水平无明显差异(P>0.05)。结论:1.特发性肺纤维化发生时PTEN/m TOR信号通路活化。2.补阳还五汤可以有效上调PTEN/m TOR通路中PTEN蛋白表达,下调m TOR蛋白、S6蛋白、p-S6蛋白表达,表明补阳还五汤可抑制PTEN/m TOR通路信号活化。3.补阳还五汤通过抑制PTEN/m TOR通路发挥对博来霉素所致肺纤维化小鼠的治疗作用。3.实验三补阳还五汤通过上调细胞自噬干预肺纤维化的机制研究目的:探索细胞自噬参与特发性肺纤维化发病的机制,及补阳还五汤对其干预作用。方法:模型制备及分组、给药、取材同实验一。采用蛋白质免疫印记法(Western blot)检测小鼠肺组织微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(Microtubule-associate Protein 1 Ligjt Chain 3,MAP1LC3-Ⅱ)蛋白、选择性自噬接头蛋白p62(sequestosome1)表达,电镜下观察小鼠肺组织自噬情况。结果:1.补阳还五汤对小鼠肺组织LC3-Ⅱ蛋白表达的影响:和假手术组相比,第7天(P<0.01),14、28天(P<0.05)模型组肺组织LC3-Ⅱ表达水平明显下降。全部给药组和同时间点模型组相比LC3-Ⅱ表达水平均有所增高(P<0.01)。在7,14天时补阳还五汤高剂量组效果最佳,与强的松组、补阳还五汤中、低剂量组相比显著增高(P<0.01),28天时与强的松组、补阳还五汤低剂量组比较增高明显(P<0.01),与补阳还五汤中剂量组比较增高明显(P<0.05)。其他各组相比无显著差异(P>0.05)。2.补阳还五汤对小鼠肺组织p62蛋白表达的影响:在7,14,28天模型组和假手术组相比,肺组织中p62表达显著上调(P<0.01)。全部给药组和同时间点的模型组相比p62表达水平有均有所降低(P<0.01)。在7,28天时,补阳还五汤高剂量组效果最佳,p62含量较其他给药组均有大幅降低(P<0.01),14天时与其他给药组相比下降明显(P<0.05)。其他各组相比无明显差异(P>0.05)。3.补阳还五汤对小鼠肺组织自噬情况的影响:7天各组小鼠肺组织自噬情况:组间细胞形态假手术组与模型组最佳,补阳还五汤高剂量组最差。补阳还五汤高剂量组自噬小体数量最多,其他组间差异性不明显。14天各组小鼠肺组织自噬情况:组间细胞形态假手术组最佳,补阳还五汤高剂量组最差。补阳还五汤高剂量组自噬水平最高,补阳还五汤中剂量组与补阳还五汤低剂量组自噬水平最低,其余组间差异性不明显。28天各组小鼠肺组织自噬情况:组间细胞形态假手术组最佳,补阳还五汤高剂量组最差。自噬水平假手术组最低,补阳还五汤高剂量组最高。结论:1.自噬不足参与特发性肺纤维化的发生。2.气虚血瘀是特发性肺纤维化的基本病机,益气活血是其治疗大法。3.补阳还五汤通过抑制PTEN/m TOR通路激活自噬发挥对博来霉素所致肺纤维化小鼠的治疗作用。