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实验目的:结直肠恶性肿瘤是目前世界上发病率较高的疾病,绝大部分患者确诊时出现局部或远处转移而无法手术根治,从而进入化疗、放疗、靶向及免疫治疗的漫长过程中。当前肠癌的化疗仍然以五氟尿嘧啶类为主,联合铂、伊立替康等,靶向治疗如大分子Bevacizumab(贝伐朱单抗),抗血管治疗如小分子酪氨酸酶抑制剂Apatinib(阿帕替尼)。目前Apatinib已经被批准用于晚期胃腺癌或胃-食管结合部腺癌患者的治疗。本文主要在细胞学水平上探索了5-Fu(五氟尿嘧啶)以及Apatinib(阿帕替尼)分别在单药、两者联合时对肠癌HT-29细胞系的增殖抑制作用。在已知Apatinib可以通过负向调控PI3K/Akt(磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶)信号通路相关的蛋白质来调控结肠癌细胞的细胞周期等的基础上,进一步探索其与5-Fu联合时对于肠癌的治疗效果以及可能的分子机制,为肠癌患者提供多线、有效、耐受更佳的治疗方案,探索更多有价值的通路,指导未来用药。研究方法:1、培养HT-29肠癌细胞系,将细胞分为对照组、5-Fu组、Apatinib组、联合组,除对照组,以不同浓度梯度顺序加入5-Fu、Apatinib、5-Fu+Apatinib。用Apatinib及5-Fu分别以单药、双药联合处理肠癌细胞系HT-29。2、用MTT法检测不同浓度下Apatinib和5-Fu单药及联合给药处理HT-29肠癌细胞系48h后细胞的增殖减弱作用,筛选出对细胞增殖抑制效果最明显的Apatinib、5-Fu的药物浓度作为优势浓度,Chou-Talalay中位效应法计算两药联合时的作用效应。3、取对数生长的细胞,用流式细胞法检测优势浓度的Apatinib及5-Fu单药及联合处理后肠癌细胞系HT-29细胞的周期及细胞凋亡情况。4、取对数生长的细胞,用平板克隆实验检测经优势浓度的Apatinib及5-Fu单药及联合处理后肠癌细胞系HT-29细胞的增殖克隆形成能力。5、取对数生长的细胞,用Western-blot法检测经优势浓度的Apatinib及5-Fu单药及联合处理后肠癌细胞系HT-29的细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达情况。实验结果:1、MTT法结果提示:与对照组相比,联合组、Apatinib组、5-Fu组细胞被处理48h后细胞增殖抑制率提高,差异均具有统计学意义(P<0.05);与Apatinib组、5-Fu组相比,联合组细胞被处理48h后细胞增殖抑制率显著提高,差异均具有统计学意义(P<0.05);Apatinib 80μmol/L+5-Fu 100μmol/L联合组抑制作用提高最为显著。Chou-Talalay中位效应法计算Apatinib与5-Fu相互作用48h引起细胞增殖抑制率为0.50效应时的CI值:CI=0.88<1。2、流式细胞术显示:与Apatinib 80μmol/L组(41.6±2.1)、5-Fu 100μmol/L(43.9±1.8)组比较,Apatinib 80μmol/L+5-Fu 100μmol/L联合组(56.1±1.5)细胞凋亡比例明显提高,差异均具有统计学意义(P<0.001)。3、克隆形成实验显示:与Apatinib 80μmol/L组61.71±1.72个、5-Fu 100μmol/L组57.75±4.21个比较,Apatinib 80μmol/L+5-Fu 100μmol/L联合组(36.12±2.16个)细胞形成能力显著降低,各组差异有统计学意义(P<0.001)。4、Western blot实验测得:对照组、阿帕替尼组、5-Fu组、联合组细胞的Akt、PI3K蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。Apatinib组、联合组细胞p-PI3K蛋白相对表达量分别为0.61±0.10,0.80±0.05;Apatinib组、联合组细胞p-Akt蛋白相对表达量分别为0.10±0.01,0.11±0.01。与空白组以及5-Fu组相比,p-PI3K、p-Akt的表达量在Apatinib组以及双药联合组中有明显的降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论1、Apatinib单药、5-Fu单药对HT-29肠癌细胞系的增殖有抑制作用。2、Apatinib和5-Fu联用可以更加明显抑制HT-29肠癌细胞系增殖,两药对肠癌细胞系HT-29细胞的增殖抑制有协同效应。3、5-Fu及Apatinib单独使用、联合应用均可促进肠癌HT-29细胞系的细胞凋亡,其中双药联用对诱导其凋亡更加有效。4、Apatinib单药可以有效的阻断Akt磷酸化为p-Akt,使其所在的通路受阻无法继续下传,使肠癌细胞的增殖减弱,诱导凋亡。双药联用无明显协同抑制p-Akt的表达效应,两药协同作用可能是通过其他机制达成。