病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物分子生物学领域中分析基因功能常用的技术手段。携带某一基因片段的病毒载体侵染后,导致植物体内同源mRNA转录水平的降解,因此属于转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。PDS和CHS分别是利用VIGS方法研究叶片和花器官中相关基因功能的常用报告基因,其沉默导致的可见表现型可用于指示VIGS沉默位置或沉默效率。病毒诱导的RNA沉默参与植株抗病毒防御反应,需要依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRs)、类似于Dicer的内切酶RNase III(Dicer-like RNase III enzymes,DCLs)及Argonaute蛋白(Argonaute proteins,AGOs)。然而,这些关键成分的转录调控尚不清楚。本研究在前期矮牵牛花器官不同发育阶段的转录组测序工作中,分离得到一个bZIP型转录因子和一个ERF型转录因子,分别命名为PhOBF1和PhERF2。选用矮牵牛(Petunia×hybrida)紫花品种‘Primetime Blue’和白花品种‘Mitchell Diploid’为材料,研究了TRV侵染、非生物因素及压力相关激素处理下的PhOBF1或PhERF2的表达模式;分析了PhOBF1或PhERF2对RNA沉默相关基因的调控和对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默效率的影响;检测了PhOBF1或PhERF2转基因植株对不同病毒侵染的抗性差异,主要取得以下结果:1.在通过转录组测序构建的矮牵牛花器官不同发育时期的cDNA文库中,分离得到PhOBF1和PhERF2的EST片段,NCBI的BLAST搜索发现两个转录因子的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。其中,PhOBF1 mRNA长度为915bp,ORF区489bp,编码162个氨基酸,5’端非编码区含有一个蔗糖控制的uORF区,长度为147bp,编码48个氨基酸,Genbank登录号:FN001301;PhERF2 mRNA长度为1308bp,ORF区1137bp,编码378个氨基酸,Genbank登录号:HQ259596。在PhOBF1和PhERF2氨基酸序列中分别含有一个bZIP保守结构域和一个AP2/ERF保守结构域。系统进化树显示,PhOBF1属于bZIP型转录因子S亚族,与拟南芥AtbZIP11高度同源;PhERF2属于ERF型转录因子VII亚族,与拟南芥AtRAP2.12和AtRAP2.2高度同源。2.TRV接种矮牵牛后,在接种叶片和顶端系统叶片中PhOBF1或PhERF2的转录水平升高,且升高的趋势与叶片中TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的积累水平一致。除了生物因素外,采用非生物因素及激素处理矮牵牛叶片,检测了两个转录因子的表达情况。结果显示,低温、干旱、脱落酸、乙烯、赤霉素和水杨酸处理诱导PhOBF1的表达,而低温、高盐碱、干旱、脱落酸、乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯处理诱导pherf2的表达。在非生物胁迫下,低温处理对phobf1或pherf2的诱导量最大,其次是干旱;而在所有激素中,水杨酸处理结果显示对phobf1或pherf2的最大诱导。表明两个转录转录因子可能在矮牵牛植株抗非生物胁迫方面扮演着重要角色。此外,乙烯处理显著诱导了phobf1或pherf2的表达,由于矮牵牛属于乙烯敏感型,乙烯是矮牵牛花朵从开放到萎蔫的主要信号,因此推断phobf1或pherf2可能参与矮牵牛花器官衰老的调节。3.以trv为载体,pds或chs为报告基因,将phobf1或pherf2片段构建到trv-phpds/chs、trv-phpds或trv-phchs中,采用注射法将转化各种trv构建物的农杆菌接种野生型矮牵牛幼苗叶片,接种未转化农杆菌用作mock对照。接种后不同时期,顶端系统侵染叶片或花瓣上始终未出现pds沉默导致的光漂白表现型或chs沉默引起的白花表现型。病毒积累水平的半定量结果显示,trvrna1(或trv1)和携带phobf1或pherf2插入片段的rna2(或trv2)成功侵染至顶端系统叶片,表明phobf1或pherf2插入片段的存在并未抑制trv载体的复制和移动,从而排除由于病毒增殖受到抑制而引起报告基因沉默失败的可能性。实时荧光定量pcr分析结果显示,trv-phpds/obf1或trv-phpds/erf2侵染的系统叶片中pds转录水平只相比于mock对照下降了30-40%,trv-phpds侵染的光漂白叶片中下降了约90%的pds转录水平。phobf1或pherf2的下调表达导致某些rna沉默相关基因rdrs、dcls和agos下降的转录水平和几乎难以检测到的sirnas积累水平。表明phobf1或pherf2可能通过调控rna沉默途径关键基因的表达,进而影响trv诱导的基因沉默效率。4.采用农杆菌介导法,生成了phobf1的rnai沉默(#2,#6和#8)和过表达(#b,#d和#h)转基因植株,或pherf2的rnai沉默(#1和#4)和过表达(#c,#d和#i)转基因植株。植株表现型观察发现phobf1影响植株高度、茎枝粗度、叶片厚度和种子大小。pherf2-rnai沉默导致植株减弱的生长势,而过表达导致增强的生长势。phobf1沉默和过表达分别显著抑制和促进了rna沉默相关基因rdr1、rdr2、dcl1、dcl2、dcl4和ago2的表达,而pherf2沉默和过表达分别显著降低和提高了rdr2、rdr6、dcl2和ago2的转录水平。trv-phpds接种phobf1或pherf2的rnai沉默和过表达转基因植株幼苗,野生型植株用作对照。接种后叶片表现型观察发现,两个转录因子的rnai沉默极大的降低了pds的沉默效率,表现为顶端系统叶片未发现明显的pds沉默导致的光漂白表现型。但是,phobf1或pherf2的过表达恢复甚至促进了pds沉默引起的光漂白表现型。实时荧光定量pcr分析显示,接种trv-phpds的phobf1或pherf2沉默转基因植株系统叶片中的pds转录水平下降了约30-40%,而接种trv-phpds的对照野生型植株系统叶片中的pds转录水平下降了约90%。phobf1或pherf2过表达导致trv-phpds侵染的系统叶片中pds转录水平也下降了90%左右。接种trv-phpds后的野生型植株和phobf1或pherf2转基因植株中的trvrna1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的积累水平存在明显差异。表明PhOBF1或PhERF2不仅参与TRV诱导的基因沉默效率的调节,还可能参与植株对TRV侵染的防御反应。此外,PhOBF1沉默和过表达分别下调和上调了莽草酸和苯丙素途径关键基因DAHPS、SK1、EPSPS、CS、CM1、ADT1、PAL1和PAL2的转录,以及下降和升高的内源水杨酸含量。外源水杨酸处理极大地诱导RDR1、RDR2、DCL1、DCL2、DCL4和AGO2的表达。表明水杨酸可能是连接PhOBF1和下游RNA沉默途径的重要中间信号。5.采用注射法接种TRV空载体或TRV-GFP载体,检测了PhOBF1-或PhERF2-RNAi沉默和过表达转基因植株对TRV的抗性。采用摩擦法接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),分别检测了PhOBF1转基因植株对TMV或PhERF2转基因植株对CMV的抗性。接种TRV-GFP后,PhOBF1沉默转基因植株接种叶片显示出比野生型植株接种叶片更大的绿色荧光相对区域,而PhOBF1过表达转基因植株接种叶片显示出较小的绿色荧光相对面积。接种TRV空载体的PhOBF1或PhERF2沉默转基因植株系统叶片出现较严重的花叶、斑驳或退绿症状,实时荧光定量PCR分析显示两者的沉默植株中具有比野生型植株更多的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)积累水平。PhOBF1过表达转基因植株系统叶片TRV侵染症状较轻,未发现明显的花叶、斑驳或退绿症状,实时荧光定量PCR分析显示,与野生型植株相比,PhOBF1过表达导致下降的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)积累水平。此外,PhOBF1沉默和过表达显著提高和降低了TMV外壳蛋白基因TMV-CP的表达水平,而PhERF2沉默和过表达显著增强和抑制了CMV外壳蛋白基因CMV-CP的表达水平。表明PhOBF1或PhERF2可能参与对多种病毒侵染的广谱的抗性反应。