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背景和目的:ENCODE计划揭示,人类基因组中70%?90%的序列具有转录能力,但只有少于2%的序列能够编码蛋白质。那些非编码序列可以通过转录形成非编码RNA（ncRNA）,从而调节生物活性。RNA之间存在着复杂的RNA-RNA网络关系,RNA通过该网络关系调节彼此的表达水平。基于此,生物学家提出了竞争内源性RNA（ceRNA）的设想。许多RNA的转录物可以与miRNA的响应元件（MRE）进行结合,减少miRNA对靶基因的抑制,从而改善靶基因的表达水平;其中RNA转录物和靶基因被称为ceRNA。虽然,在不同的生物活动中,都发现了这种ceRNA的调节方法,但关于究竟是哪种基因对肿瘤产生ceRNA功能的研究却少之又少。原发性肝癌是最常见的临床恶性肿瘤之一,具有很高的死亡率,在肿瘤相关疾病死亡率中名列第二。目前,肝癌的分子机制尚不清楚。有关基因的研究主要聚焦于miRNA,lncRNA,circRNA和mRNA。当前,有关ceRNA在肝癌发生和发展过程中对cycRNA-mRNA调控的研究已成为热点。MiRNA是一种长度为22nt的小单链非编码RNA,在ceRNA中起关键作用。成熟的miRNA可以快速整合到miRNA诱导的沉默复合体中,并通过与mRNA的3’非编码区进行互补整合来抑制RNA的翻译,从而负调节mRNA的表达。MiRNA的表达障碍是导致一系列肿瘤（包括肝癌）形成的关键因素。研究表明,许多miRNA会参与细胞周期的调节,这些与细胞周期相关的miRNA的表达障碍可能会导致细胞周期紊乱,从而诱导肿瘤形成。CircRNA是一种具有重要生物学功能的RNA分子,但长期以来并没有得到应有的重视。早在1976年,人类就首次在病毒中发现了circRNA。circRNA通常是一种由外显子组成的环状RNA。近年来,一些研究表明,circRNA内含有大量miRNA反应元件,且circRNA具备ceRNA的功能,因此被视为是ceRNA的新成员。随着对circRNA的研究和探索不断深入,其在肿瘤发生过程中的作用已逐渐被人们所知悉。最新研究表明,hsa-circ-0005075可以与靶基因的miRNA（包括miR-23b-5p,miR-93-3p,miR-581和miR-23a-5p）相互作用,以消除或减轻靶基因的抑制作用,从而加快肝癌的发展。通过检测miRNA在肝癌细胞中的表达,研究发现10个上调miRNA和10个下调miRNA,其中与相邻非肿瘤组织中的mir-138相比,mir-138在77.8%的肝癌组织中的表达出现了下调。不过,最近的一项circRNA研究表明,hsa-circ-0000524在肝癌组织中的表达是上调的。因此,在本研究中,我们提出hsacirc0000524在肝癌组织中的下调可促进miR-138的表达,从而调节miR-138介导的信号通路,并进一步抑制肿瘤的形成。第一部分肝癌组织中hsacirc0000524的表达量分析方法:1.通过RT-PCR技术对HCC组织中的hsacirc0000524表达水平进行测定。2.通过RT-PCR技术对HCC细胞系中的hsacirc0000524表达水平进行测定。结果:1.相较于癌旁正常组织,hsacirc0000524的表达量在肝癌组织中显著升高（P<0.01）。2.相较于正常肝细胞系HL-7702,hsacirc0000524的表达量在肝癌细胞系HepG2,HHCC,HUH7,和BEL-7402中均显著升高（P<0.01）。第二部分下调hsacirc0000524抑制肝癌细胞的生长和迁移方法:1.通过转染hsacirc0000524 siRNA沉默hsacirc0000524在HCC细胞系HepG2中的表达。2.通过活细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）和EdU检测对细胞活力进行测定。3.通过DNA结合染料（PI）对细胞中的DNA进行定量分析。4.通过细胞创伤愈合实验和Transwell细胞迁移实验检验细胞迁移能力。结果:1.hsacirc0000524 siRNA降低hsacirc0000524在HepG2细胞中的表达。2.下调hsacirc0000524降低肝癌细胞的活力。3.下调hsacirc0000524可以阻碍肝癌细胞从G0/G1期到S期的转化,从而抑制细胞的生长。4.下调hsacirc0000524抑制细胞迁移。第三部分hsacirc0000524负调控miR-138在肝癌细胞中的表达方法:1.利用TargetScan对hsacirc0000524与miR-138的相互结合位点进行预测。2.利用RT-PCR对肝癌组织及癌旁正常组织中miR-138的表达量进行分析。3.利用RT-PCR对不同肝癌细胞中miR-138的表达量进行分析。4.将hsacirc0000524 siRNA转染HepG2肝癌细胞,从而下调hsacirc0000524的表达量。同时,利用RT-PCR对HepG2细胞中的miR-138的表达量进行检测。5.利用Western blot对miR-138相关靶蛋白的表达量进行分析。结果:1.TargetScan预测结果表明hsacirc0000524与miR-138有结合位点。2.相较于癌旁正常组织,miR-138的表达量在肝癌组织中显著降低（P<0.01）。miR-138在肝癌细胞中低表达。3.相较于正常肝细胞系HL-7702,miR-138的表达量在肝癌细胞系HepG2,HHCC,HUH7,和BEL-7402中均显著降低（P<0.01）。4.利用hsacirc0000524 siRNA转染HepG2肝癌细胞,从而下调hsacirc0000524的表达量。同时,利用RT-PCR对HepG2细胞中的miR-138的表达量进行检测,结果表明,相较于对照组,miR-138的表达量显著增加（P<0.01）。5.Western blot结果表明,在转染hsacirc0000524 siRNA的HepG2细胞中,miR-138相关靶蛋白vimentin和CCND3的表达量降低。第四部分hsacirc0000524通过抑制miR-138影响肝癌细胞的生长和迁移方法:1.设计合成了hsacirc0000524模拟物（mimics）,miR-138的模拟物及抑制剂（inhibitor）。分别将hsacirc0000524mimics单独转染以及miR-138 mimic和inhibitor与hsacirc0000524 siRNA共转染HepG2肝癌细胞。2.利用CCK-8法分别对hsacirc0000524 mimics单独转染以及miR-138mimic和inhibitor与hsacirc0000524 siRNA共转染后的HepG2肝癌细胞的活力进行检测。3.分别利用细胞创伤愈合实验和transwell细胞迁移实验对干扰hsacirc0000524或者干扰miR-138后的细胞的迁移能力进行检测。4.Western blot检测干扰hsacirc0000524或者干扰miR-138后miR-138相关靶蛋白的表达。结果:1.当转染si-hsacirc0000524后,miR-138的表达量相较于转染hsacirc0000524mimics对照组显著升高（P<0.01）;当转染si-hsacirc0000524与miR-138 inhibitor,miR-138的表达量相较于转染hsacirc0000524 mimics对照组显著降低（P<0.01）;当转染si-hsacirc0000524与miR-138 mimics,miR-138的表达量相较于转染hsacirc0000524 mimics对照组显著升高（P<0.01）。2.当miR-138 mimic与hsacirc0000524 siRNA共转染72小时后,相较于阴性对照组,HepG2细胞的活力降低;当miR-138 inhibitor与hsacirc0000524siRNA共转染72小时后,相较于阴性对照组,HepG2细胞的活力升高;当转染hsacirc0000524 mimics 72小时后,相较于阴性对照组,HepG2细胞的活力升高。3.当转染si-hsacirc0000524于HepG2细胞,相较于hsacirc0000524mimics对照组,HepG2细胞的创伤愈合能力较弱,迁移能力显著降低（P<0.01）;当miR-138 mimic与hsacirc0000524 siRNA共转染HepG2细胞,相较于hsacirc0000524 mimics对照组,HepG2细胞的创伤愈合能力较弱,迁移能力显著降低（P<0.01）;当miR-138 inhibitor与hsacirc0000524 siRNA共转染HepG2细胞,相较于hsacirc0000524 mimics对照组,HepG2细胞的创伤愈合能力增强,迁移能力显著升高（P<0.01）。4.当miR-138 mimic与hsacirc0000524 siRNA共转染HepG2细胞,相较于阴性对照组,vimentin和CCND3的表达量降低;当miR-138 inhibitor与hsacirc0000524 siRNA共转染HepG2细胞,相较于阴性对照组,vimentin和CCND3的表达量升高;当转染hsacirc0000524 mimics于HepG2细胞后,相较于阴性对照组,vimentin和CCND3的表达量升高。第五部分下调hsacirc0000524抑制肝癌细胞肿瘤发生方法:1.取6只健康裸鼠建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型。2.将6只植瘤后裸鼠随机分为2组,分别命名为实验组（shRNA组）、阴性对照组（空载慢病毒组）。利用慢病毒转染hsacirc0000524 shRNA。3.利用免疫组织化学和HE染色的方法对转染后肿瘤组织进行切片观察。4.利用RT-PCR对转染后肿瘤组织中hsacirc0000524和miR-138的表达量进行了定量分析。5.Western blot检测miR-138相关靶蛋白在移植瘤组织中的表达量。结果:1.当MOI=200时,80%以上细胞成功感染hsacirc0000524 shRNA。2.阴性对照组瘤体体积在21天内,显著增大。然而,转染hsacirc0000524shRNA后瘤体体积变化较小。3.相较于阴性对照组,转染后,hsacirc0000524的表达量显著降低。下调hsacirc0000524后,肝癌组织中的miR-138的表达量相较于阴性对照组显著提高。4.HE染色和免疫组化染色检测HCC组织中Ki67蛋白的表达表明hsacirc0000524的下调对裸鼠中肿瘤发生有抑制作用。5.hsacirc0000524 shRNA转染后,相较于阴性对照组,vimentin和CCND3的表达量降低。结论:肝癌组织中hsacirc0000524的下调能够通过促进miR-138的表达来调节miR-138介导的信号通路,进而促进肿瘤发生。对miRNA和circRNA参与肝癌进程的机制进行深入研究将为以后的肝癌临床治疗提供基础,并且为人类战胜肝癌打开了新的视野。