草莓‘红颊’快速繁殖及遗传转化体系研究与应用

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本试验以草莓栽培品种‘红颊’为试材,研究了表面消毒剂、处理时间、外植体生长发育时期对茎尖存活率的影响,及初代培养基、激素、pH、糖浓度及氮源等因素对不定芽诱导的影响,并对脱毒苗果实的可溶性糖含量和氨基酸含量进行测定;并以此为基础,进行了叶片、叶柄、短缩茎等离体再生体系研究,探讨了基本培养基、暗培养、放置方式、叶龄对叶片离体再生的影响,及激素组合对叶片、叶柄、短缩茎离体再生的影响,建立了高效再生体系。利用农杆菌介导AtCYP2基因转化‘红颊’,获得了19个独立转化子,经PCR检测,获得4个阳性独立转化子。1‘红颊’茎尖快繁体系的建立(1)通过对匍匐茎茎尖表面消毒效果的研究发现:以未展开的匍匐茎茎尖作为外植体、0.1% HgCl2附加2%吐温-100溶液处理8 min、以MS或MS+0. 5 mg/L 6-BA为初代培养基,外植体污染及褐化水平最低,成苗率最高,达87%。(2)继代增殖中6-BA浓度0.3 mg/L和0.5 mg/L交替使用。此外,0.5 mg/L6-BA和0.3 mg/L GA组合培养,具有壮苗作用;而1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/LJBA组合培养基上能够生产匍匐茎。(3)在1/2MS+0.01 mg/L NAA+20 g/L蔗糖(pH 6.0±0.2)培养基上,生根率最高,植株平均根数亦最高,并且根系粗壮,长势良好。(4)对‘红颊’进行增殖培养时,保持氮素总量不变,NH4NO3的氮素可分别用同形式的KN03和(NH4)2O4等摩尔当量替代,不影响植株正常生长。与继代增殖相比,氮素存在形式对‘红颊’组培苗生根的影响较小。(5)‘红颊’脱毒苗第一年果实的可溶性糖含量和游离氨基酸含量均比非脱毒苗果实的含量高。2‘红颊’叶片、叶柄、短缩茎再生体系的建立(1)通过对叶片离体再生的研究,发现’红颊’叶片离体再生的最佳诱导方式为:以近心叶第二、三片叶子为材料,远轴面(背面)接触培养基MS+2.0mg/L TDZ+0.1 mg/LNAA,暗培养7d,愈伤组织诱导率达91.4%。(2)叶柄的不定芽最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA,不定芽诱导率为77.8%。(3)短缩茎离体再生的最佳诱导培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,愈伤组织诱导率为71.9%,愈伤组织分化率为68.7%。3‘红颊’遗传转化体系的建立(1)通过草莓对潮霉素(hygromycin, HmB)的敏感性试验,发现HmB为20mg/L时,只有小部分嫩芽有生长现象,且新叶呈黄白色,无法正常发育;当HmB达到30mg/l时,茎尖全部死亡。(2)转化过程中,预培养2-4 d、侵染8-10min提高了转化率。(3)经HmB抗性筛选和PCR检测,获得4个转化了AtCYP2基因的阳性独立转化子。
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