背景随着人们生活方式的改变以及人口老龄化时代的到来,颈肩腰腿痛(neck shoulder pain or lumbocrural pain, NSCP)目前已成为骨科最常见的疾病,同时这也是导致残疾及劳动力丧失的主要原因之一。据最新的流行病学调查数据显示,约80%的人在一生中至少会有一次NSCP的经历,受累人群之多给社会带来了巨大的经济负担。因此,寻求针对NSCP的有效治疗是当前医疗卫生领域亟待解决的重要问题之一。目前普遍认为椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD)是引起NSCP的主要原因,但对于椎间盘退变的发病机制尚不清楚。但是,应当明确的是椎间盘退变是由遗传、年龄、应力、创伤、职业等多因素综合作用引起的。除上述因素作用外,人类的椎间盘内脊索细胞及椎间盘血液供应在成年后消失使得椎间盘的再生能力要弱于富血管组织。综上,种种不利因素综合作用最终导致椎间盘的退变无法逆转。当前临床上针对椎间盘退变引起的NSCP的治疗方法主要有保守治疗和手术治疗。保守治疗具体包括：药物治疗、针灸、理疗等,但仅能暂时缓解疼痛症状,无法延缓椎间盘的进一步退变。手术治疗常作为保守治疗无效后首选的治疗手段,具体包括髓核摘除术、脊柱融合术、人工椎间盘置换术等,虽然其疗效较持久、稳定,但是术后复发及相邻节段退变等问题使医生及患者均备受困扰。因此,寻求一种新的治疗手段是当前椎间盘疾病治疗的重要任务,生物治疗技术为椎间盘的再生提供了新的治疗选择。研究发现,在椎间盘损伤退变的过程中仍然有内源性修复过程的参与。这种椎间盘内源性修复主要通过两方面作用来实现。一方面是椎间盘内源性细胞发挥修复作用,主要通过椎间盘终末细胞(髓核细胞、纤维环细胞、终板软骨细胞)分泌细胞外基质以及椎间盘干细胞(髓核基质干细胞、纤维环基质干细胞、终板软骨干细胞)分化为椎间盘终末细胞来实现；另一方面是通过骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)发挥修复作用,在椎间盘退变的过程中,椎间盘细胞表达并分泌大量生长因子,促进BMSCs从相邻椎体骨髓穿终板进入椎间盘内参与其修复过程。因此,通过促进椎间盘修复的正平衡状态——激活椎间盘内源性细胞的修复作用以及促进外源性干细胞向椎间盘内趋化募集修复作用,有望成为椎间盘退变生物治疗的新方法。骨形态发生蛋白-7 (bone morphogenetic protein-7, BMP-7)作为转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)家族的重要成员,具有与TGF-P相似的成软骨作用,还能够激活软骨细胞及髓核细胞的生物学功能。一方面,BMP-7在体外能够促进髓核细胞蛋白聚糖(aggrecan, AGG)、Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen, COLⅡ)、人性别决定区Y框蛋白9 (sex determining region Y-box 9, SOX-9)目关基因的表达以及促进AGG及COLⅡ蛋白的分泌,促进髓核细胞的增殖以及抑制髓核细胞的凋亡等；另一方面,BMP-7能够促进BMSCs趋化迁移并促进其向软骨细胞分化。由此,根据椎间盘内源性修复的特点,若将BMP-7作为候选因子,有望同时发挥激活椎间盘内源性细胞以及募集椎间盘外BMSCs进入椎间盘内的作用。然而,单独使用生长因子半衰期较短,需要往体内反复多次注射才能维持作用。此外,最新动物实验表明,BMP-7直接注射入椎间盘内还存在成骨等风险。研究发现BMP-7具有三个活性片段：SNVI、KPSS、KAIS,在单活性片段作用的情况下,KPSS促进细胞增殖的能力最强,但成骨能力最弱。本课题组前期将BMP-7的三种生物活性片段分别加载至自组装多肽纳米纤维材料RADA16-I的C’末端,组成功能化自组装多肽纳米纤维材料RADA-SNVI, RADA-KPSS, RADA-KAIS。再将三种功能化自组装多肽纳米纤维材料与RADA16-I以1：1体积比例混合后制成新型混合功能化自组装多肽纳米纤维材料RADSNV、RADKPS、RADKAI。在综合比较之后,体外研究发现载有KPSS片段的RADKPS促进椎间盘内源性细胞分泌AGG及COLII的能力最强,且作用持续时间较单独使用BMP-7长。然而,对于RADKPS对BMSCs的趋化迁移分化作用及其在体内延缓椎间盘退变的作用尚缺乏相应的研究。因此,在前期研究基础上,本研究拟进一步探究RADKPS的体外及体内生物学作用：1、探究RADKPS体外趋化募集人BMSCs的作用,并利用椎间盘器官培养模型模拟RADKPS在椎间盘内促进人BMSCs从终板迁移至髓核的过程。2、探究RADKPS对人BMSCs增殖及向髓核样细胞分化的作用。3、将RADKPS注入兔退变椎间盘内,观察其延缓椎间盘退变的作用,同时予以静脉注射PKH26标记的人BMSCs,观察RADKPS在体内促进BMSCs向椎间盘内趋化迁移的作用。第一章RADKPS体外对人BMSCs趋化迁移的影响目的：通过Transwell小室模型及牛尾椎间盘器官培养模型观察RADKPS在体外对人BMSCs的趋化迁移的影响。方法：1.委托杭州中肽生化有限公司合成RADA16-I及复合有BMP-7功能片段的RADA-KPSS。将两种多肽粉末(RADA16-I/RADA16-KPSS)以质量体积比为10%的蔗糖水充分溶解,得到浓度均为1mg/mL的两种多肽溶液。将RADA16-I与RADA-KPSS以等体积比例混合得到RADKPS溶液。在24孔板的孔中加入400μL/孔无血清培养基(serum free dulbecco’s modified eagle medium, SF-DMEM)。再将Transwell小室放置于孔中,分别于每孔中加入100 μL体积的RADA16-1或者RADKPS溶液,置于培养箱中孵育30 min后观察成胶性能,再通过HE染色观察水凝胶的组织学结构。2.通过梯度离心法分离人原代BMSCs,体外扩增培养获取P3代人BMSCs,经三系诱导分化(成骨、成脂肪、成软骨诱导)后,茜素红染色、油红O染色及COLII免疫细胞化学染色鉴定成骨、成脂及成软骨分化能力,将P3代人BMSCs用SF-DMEM制成细胞悬液备用。3.利用Transwell小室模型体外探究RADKPS趋化迁移人BMSCs的能力。实验分为三组：RADKPS组、RADA16-I组、SF-DMEM组,在24孔板的每孔中加入400μL前述三组溶液。然后将P3代人BMSCs用SF-DMEM配制成浓度为1×105/mL细胞悬液,将100μL此细胞悬液(共1×104个细胞)加入到Transwell小室内,置于上述24孔板内。在培养箱中孵育48 h后,通过结晶紫染色观察迁移至Transwell小室滤膜下层细胞,并统计每视野下(×100)细胞的数量。4.利用牛尾椎间盘器官培养模型观察RADKPS促进人BMSCs从软骨终板表面向髓核组织趋化迁移的效果。无菌条件下分离牛尾脊柱功能单位,利用磨钻去除椎体骨而保留软骨终板。将一侧纤维环纵向切开,用髓核钳摘除少量髓核组织,再将50 μL体积的RADKPS、RADA16-I及SF-DMEM溶液注入髓核缺损处,用缝合线将纤维环内外层缝合,置于6孔板中并在培养箱中预先孵育24 h。将P3代人BMSCs用PKH26荧光染液标记,将标记后的细胞(1×106个)接种至牛尾椎间盘软骨终板上方。待细胞“贴壁”后,加完全培养液至没过椎间盘,置于培养箱内培养48 h。经甲醛固定、石蜡包埋后,沿着椎间盘冠状面中央进行切片,在荧光倒置显微镜下进行观察,计数髓核组织中带红色荧光的细胞数量。结果：RADKPS及RADA16-I在体外接触无血清培养液后均能迅速成胶,同时HE染色观察提示多肽支架结构均一且红染。P3代BMSCs经成骨、成脂、成软骨诱导后,相应的茜素红、油红O、COLII免疫细胞化学染色均为阳性。体外迁移实验进行48 h后,RADKPS组迁移至小室滤膜下层的细胞个数为115.33±11.30,在RADA16-I组为20.89±5.49,在SF-DMEM组为8.44±2.65,RADKPS>RADA16-I> SF-DMEM组,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。在牛尾椎间盘器官培养模型中,结果显示在冠状位正中切面上,RADKPS组髓核组织内的人BMSCs数量为41.75±10.81,而在RADA16-I与SF-DMEM组分别为16.25±6.13与10.00±4.16,RADKPS组高于其余两组(P<0.05), RADA16-I与SF-DMEM组无统计学差异(P>0.05)。结论：RADKPS及RADA16-I在Transwell小室模型中均能促进人BMSCs的趋化迁移,且RADKPS的作用要优于RADA16-I,而在牛尾椎间盘器官培养模型中,仅RADKPS能够促进人BMSCs向椎间盘内迁移。第二章RADKPS对人BMSCs向髓核细胞分化的影响目的：观察RADKPS对人BMSCs的活性、增殖及向髓核样细胞分化的作用。方法：1.用完全培养基将P3代人BMSCs配成指定密度的细胞悬液(不同检测配不同密度),与RADKPS或RADA16-I分别以1：5体积比例混合构建细胞-水凝胶复合物。通过FDA/PI染液检测细胞-水凝胶复合物在培养7天后的活性,同时通过MTT法检测细胞-水凝胶复合物培养12 h、3天及7天时细胞增殖的情况。2.按照步骤1构建细胞-水凝胶复合物,体外培养21天,通过实时荧光定量PCR检测髓核细胞表型SOX-9、COLⅡ、碳酸酐酶-12 (carbonic anhydrase-12, CA-12)、角蛋白-19 (Keratin-19, KRT-19)、AGG的mRNA相对表达量。再通过酶联免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞-水凝胶复合物培养7天,21天时COLII及AGG的含量。结果：细胞-水凝胶复合物在体外培养7天时,RADKPS及RADA16-I均使细胞活性维持在90%左右。MTT法细胞增殖检测显示在体外培养12 h及3天时,RADKPS组与RADA16-I组细胞数量无明显差异(P>0.05),第7天时细胞数量在RADKPS组多于RADA16-I组(P<0.05)。在体外培养21天时,PCR检测RADKPS组的人BMSCs表达SOX-9、COLⅡ、CA-12、KRT-19及AGG的mRNA水平均高于RADA16-I组(P<0.05)。ELISA检测提示在体外培养7天时,RADKPS组COLII的含量仅轻度高于RADA16-I组,但差异无统计学意义(P>0.05),而在体外培养21天时,RADKPS组COLII的含量高于RADA16-I组(P<0.05)。在第7天,21天时,RADKPS组AGG的含量均高于RADA16-I组(P<0.05)。结论：与RADA16-I相比,载有BMP-7功能短肽片段的RADKPS在体外能够维持人BMSCs的活性并促进其增殖能力,同时能够促进人BMSCs向髓核细胞分化。第三章RADKPS延缓兔椎间盘退变的实验研究目的：通过动物实验观察RADKPS延缓兔椎间盘退变的作用及其在椎间盘内募集人BMSCs的作用。方法：1.通过核磁共振检查(Magnetic Resonance Imaging, MRI)选取椎间盘正常的新西兰大白兔24只(雌雄不限,体重约2.5-3kg)。肌肉注射麻醉及无菌条件下,经腹膜后外侧(左侧)入路暴露L2-L5椎体间的3个椎间盘,利用带21G针头的10 mL注射器向髓核中央方向穿刺纤维环至一定深度并在恒定负压作用下抽吸出适量髓核组织以诱导椎间盘退变。2.在造模手术4周后,通过X线检查及MRI扫描对兔椎间盘退变程度进行评估,根据退变腰椎间盘核磁Pfirrmann分级,选择椎间盘退变程度在Ⅱ-Ⅲ级的兔子纳入后续治疗干预实验。将同一兔子的退变椎间盘(L2-L5)及L5-6正常椎间盘分成以下四组：PBS缓冲液(L2-L3)、RADA16-I溶液(L3-L4)、RADKPS溶液(L4-L5),L5-6椎间盘作为正常对照组。在肌肉注射麻醉及无菌条件下,经腹膜后外侧(右侧)入路暴露L2-L5节段间的三个椎间盘,用Hamilton微量注射器(27G针头)分别往相应椎间盘内注射20 μL的PBS缓冲液、RADA16-I溶液>RADKPS溶液。在治疗干预术后4周,将1 mL密度为1×106/mL的PKH26标记人BMSCs细胞悬液注入耳缘静脉。3.在治疗干预术后4周、16周进行X线检查及MRI检查评估不同治疗干预组的效果,X线检查观察骨赘形成及相对椎间盘高度指数(Relative Disc Height Index,%DHI), MRI检查观察椎间盘的相对灰度值指数(Relative Gray Index. RGI)。在治疗干预16周行X线检查及MRI检查之后,将实验动物通过空气栓塞处死,获取所有L2-L6椎体间的椎间盘,保留两端部分椎体骨后置入10%福尔马林溶液中固定48 h。经乙二胺四乙酸二钠(disodium ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)脱钙、蜡块包埋并切片后,一部分切片行番红O及HE染色观察组织学变化,一部分切片行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色后,在荧光显微镜下观察通过静脉注射的人BMSCs向目标椎间盘内迁移的情况。另一部分切片行转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling; TUNEL)荧光染色观察细胞凋亡情况。将剩余新鲜椎间盘横行切开取出髓核组织并保存于液氮中,用ELISA检测定量分析髓核组织COLII及AGG含量。结果：MRI及X线检查结果提示,在造模手术前及造模手术4周后,L2-3、L3-4、L4-5节段椎间盘%DHI及RGI在不同节段间无明显统计学差异(P>0.05)。在治疗干预手术后4周及16周,X线检查提示在不同实验组间%DHI无差异(P>0.05),但均显著低于正常对照组(P<0.05)。在治疗干预术后4周及16周,MRI检查提示髓核组织RGI在RADKPS组均要高于RADA16-I组及PBS组(P<0.05), RADA16-I组相对于PBS组无明显差异(P>0.05),三治疗干预组均显著低于正常对照组(P<0.05)。在治疗干预16周后,番红O染色提示,正常对照组髓核组织深染,RADKPS组染色强度强于其余两干预组。HE染色提示正常对照组椎间盘髓核及纤维环界限明显,仍可见团簇样的巨大细胞群,在RADKPS组髓核组织与纤维环组织交界仍存在,保留有较多软骨样细胞,而在RADA16-I组及PBS组中,髓核及纤维环的界限不清,软骨样细胞逐渐向成纤维样细胞转变,细胞数量也逐渐减少。经DAPI染色后,通过荧光显微镜观察发现在RADKPS组见少量PKH26标记的人BMSCs呈红色荧光,细胞核结构正常,而其余各组未见红色荧光。TUNEL荧光染色显示,正常对照组髓核组织鲜有凋亡细胞,RADKPS组凋亡细胞占所有髓核细胞的比值要低于RADA16-I组及PBS组(P<0.05)。新鲜髓核组织ELISA检测提示,在治疗干预术后16周,RADKPS组AGG及COLII的含量均高于RADA16-I及PBS组(P<0.05),但低于正常对照组(P<0.05)。结论：与RADA16-I比较,RADKPS能够延缓兔椎间盘的退变过程,此作用可能是通过减少兔退变椎间盘内源性细胞凋亡、促进AGG及COLII的合成分泌以及促进BMSCs向椎间盘内迁移实现的。