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动物的季节性繁殖是指动物只在特定季节进行繁殖活动的现象。季节性繁殖动物通过整合光信号(光周期)与其它环境因子(食物丰度、温度等)来调控它们的繁殖活动。动物的生理状态随着外部环境信号的改变而改变。为了获得最大的繁殖成功率,季节性繁殖动物只在一年最适宜的某个时间段进行繁殖活动,以保证母体和后代最大的存活率。这也就造成了动物种群数量在季节间的波动现象。 黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是一种典型的季节性繁殖动物,在我国华北地区有广泛分布。它的繁殖活动受到外界光周期、温度、食物等因素的调控,黑线仓鼠在春、秋季节出现繁殖高峰期,季节间种群数量出现较大的波动。黑线仓鼠也是华北地区一主要的农业害鼠,喜食作物种子;在作物发芽生长期,取食作物的茎和嫩叶,这样对农作物生产造成较大的损害,造成作物产量大大减少。华北平原主要是种植农作物,粮食作物主要为小麦和玉米,黑线仓鼠的大量繁殖,除了对该地区的农作物生产造成损失外,黑线仓鼠自身也极易携带可传播的病毒,对人们的健康生活也造成了一定程度的威胁。因此研究其繁殖机制、控制黑线仓鼠的繁殖活动,显得尤为重要。 本研究以从山东省临沂市捕获的野生黑线仓鼠为实验材料,从与黑线仓鼠繁殖活动密切相关的繁殖基因入手,通过对黑线仓鼠进行不同光周期、限食和雌激素注射处理,利用实时荧光定量PCR技术,对不同方式处理的黑线仓鼠不同组织中的相关繁殖基因的表达量进行分析。首先,以黑线仓鼠下丘脑为材料,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,克隆得到了GPR147的部分cDNA片段,长355bp,属于编码区序列。对不同季节黑线仓鼠下丘脑和卵巢、睾丸中的GPR147相对定量结果显示GPR147在下丘脑、睾丸中的表达模式均是非繁殖期表达量显著高于繁殖期(P<0.05),与黑线仓鼠的繁殖规律相一致,表明在黑线仓鼠的非繁殖季节,RFRP-3通过GPR147对黑线仓鼠的繁殖发挥抑制作用。 其次,通过不同的光周期(16L:8D,12L:12D,8L:16D)处理黑线仓鼠,利用实时荧光定量PCR技术,检测RFRP-3/GPR147等基因在雌、雄黑线仓鼠不同组织中的相对表达量。长光照周期处理的黑线仓鼠,雌、雄下丘脑中RFRP-3的表达量显著高于(P<0.05)短光照周期处理黑线仓鼠的表达。下丘脑中GnRH的表达量随着光照时间的增加,表达量显著增高,并且长光照周期下的表达量显著高于(P<0.05)短光照周期。下丘脑中雌激素受体(ER)的表达量短光照>长光照>中光照周期,并且短光照周期下的表达量显著高于(P<0.05)长光照。下丘脑中GPR147的表达量短光照周期下显著高于(P<0.05)长光照,与RFRP-3的表达呈现出相反的表达模式。实验结果分析RFRP-3在长光照周期下表达上调,可能与黑线仓鼠机体中长光照下褪黑激素的分泌有关。 第三,本研究对实验对象的体重变化进行监测,并对限食组与对照组雄性黑线仓鼠下丘脑与性腺中,RFRP-3/GPR147和GnRH的表达量进行了差异显著性检验,结果表明限食组的体重显下降(P<0.05),RFRP-3/GPR147和GnRH在限食组的表达量显著高于对照组(P<0.05);并且限食组的体重显著低于对照组(P<0.05)。结果表明RFRP-3/GPR147系统可能参与了能量平衡对黑线仓鼠繁殖活动的调控。 最后,本研究对雌性黑线仓鼠注射外源雌激素,用实时荧光定量PCR技术,检测RFRP-3/GPR147、ER和GnRH的表达量。处理组与对照组相比,下丘脑中RFRP-3的表达量显著升高(P<0.05),提示雌激素能够上调RFRP-3的表达来增加它对繁殖活动的负反馈作用。下丘脑中ER的表达量也显著上升,表明体内雌激素水平升高,导致雌激素受体的表达水平显著升高(P<0.05),雌激素通过其受体作用于RFRP-3神经元,RFRP-3表达水平升高,进而GnRH的表达受到抑制,HPG的兴奋性被抑制,并且雌激素对ER的作用存在剂量依赖性。卵巢中高浓度的外源雌激素注射使RFRP-3/GPR147的表达显著升高,ER的量也显著的升高。下丘脑中GnRH的表达量在低浓度下显著升高(P<0.05),在高浓度雌激素注射下表达量降低,但是卵巢中GnRH变化不显著。结果表明,在不同雌激素浓度的条件下,雌激素对不同部位,RFRP-3/GPR147或者Kiss-1/GPR54系统的不同反馈作用有关。低浓度水平下,可能雌激素通过另外的调控通路,引起GnRH表达水平的升高,随着浓度的升高,抑制作用逐渐增强。