背景:嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是一种发展迅速的肿瘤免疫治疗策略,在癌症个体化免疫治疗方面表现出了巨大的前景。该技术是将抗体对抗原的高度特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒活性相结合的一种方法。然而CAR-T细胞的广泛应用仍面临一些艰巨的挑战,T细胞慢病毒转染效率低、CAR-T细胞功能受到抑制、CAR-T细胞输注后缺乏持续性、肿瘤细胞抗原表达缺失引起免疫逃逸等。慢病毒载体能够通过整合到宿主基因组,稳定转染分裂或非分裂的细胞。此外,这些载体对人体无毒,可使转染的原代T细胞获得长期稳定的基因表达。但是,目前慢病毒介导的T细胞转染面临着低转染效率的局限性,如何提高慢病毒转染效率仍然是一个挑战。考虑到CAR-T细胞在患者体内持续性差,增加低分化CAR-T细胞的占比可有效提高CAR-T细胞持久抗瘤的效果。尽管低分化T细胞群具有明显的优势,但由于缺乏生产低分化CAR-T细胞的合适方法,目前大多数过继性细胞疗法仍依赖于终末分化型CAR-T细胞。因此,优化制备方法以获得高质量的CAR-T细胞非常重要。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区。单一的CAR骨架构成为其在临床应用中提供了很大的灵活性,但是,这种简单的结构并不能模拟真实、精密而复杂的TCR识别模式。天然状态下的T细胞能对抗原提呈细胞表面的单个抗原肽-MHC分子复合物做出反应,而在CAR-T细胞活化中,尽管抗原抗体识别具有很强的亲和力,但比天然状态下的T细胞需要更多更强的靶抗原表达才能有效激活CAR-T细胞。实验研究表明超过20%的病人在接受CD19-CAR-T细胞治疗后出现癌症复发,以及在最近的CD22-CAR临床试验中,超过50%的患者在获得完全缓解后出现疾病的复发,而复发的主要原因是肿瘤细胞的靶抗原表达降低,从而导致免疫逃逸。因此,如何根据天然状态下T细胞的识别程序来优化CAR-T细胞的结构设计,提高CAR-T细胞对靶抗原低表达的肿瘤细胞的识别和杀伤,有利于开发出更有效的CAR-T治疗方法。γC家族细胞因子在促进T细胞生长、对抗肿瘤和促使记忆性T细胞的生成以抵抗肿瘤转移或复发方面发挥关键作用。白介素-21（Interleukin-21,IL-21）主要激活的信号转导和转录激活因子不同于其他γC家族的细胞因子,使其在抗肿瘤免疫中有其独特的作用。本实验旨在探究在CAR-T制备过程中添加IL-21会对CAR-T的生产带来哪些影响,从而优化CAR-T细胞的制备过程。目前所知,最少有三种酪氨酸激酶参与了T细胞活化的早期磷酸化事件。其中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(P56Lymphocyte-specific tyrosine kinase,P56LCK)主要表达在T细胞的细胞膜上和细胞质中。遗传学研究表明P56LCK对T细胞的活化十分重要,P56LCK的缺失突变可致T细胞的发育不良。在T细胞的免疫突触形成过程中,配体与受体结合引起膜受体位置和构型改变,膜受体发生交联。CD3、CD4或CD8分子的胞浆区尾部聚集在一起,CD4或CD8分子胞内区相连的蛋白酪氨酸激酶P56LCK发生磷酸化而激活,继而使CD3分子中的免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM）发生酪氨酸磷酸化激活T细胞。而CD4和CD8分子与P56LCK结合的区域是一段相似的包含两个半胱氨酸的带负电荷区域。我们将设计的优化的半胱氨酸序列串联到CAR的胞内区,探究该优化结构对CAR-T细胞的抗肿瘤能力的影响。我们希望通过优化CAR-T细胞的制备过程和CAR结构提高CAR-T细胞抗肿瘤效果,为临床CAR-T细胞技术更好的应用提供参考。方法:（1）采用分子克隆构建人类表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）CAR质粒,和TR1419-28ξCAR（28CAR）、TR1419-BBξCAR（137CAR）、优化质粒TR1419-BBξLCK1CAR（137LCK1）、优化质粒TR1419-BBξLCK2CAR（137LCK2）及其他相关质粒,并进行酶切和测序验证。（2）设计8组细胞因子组合（不含IL-21:白介素-2（Interleukin-2,IL-2）、白介素-7（Interleukin-7,IL-7）、白介素-15（Interleukin-15,IL-15）、IL-7+IL-15;含IL-21:IL-2+IL-21、IL-7+IL-21、IL-15+IL-21、IL-7+IL-15+IL-21）,分别用于培养制备HER-CAR-T细胞,采用自动细胞计数仪计数不同细胞因子组合培养的T细胞数,流式细胞术检测不同细胞因子组合培养的T细胞的CAR转染率和HER-CAR-T细胞的表型。（3）流式细胞术检测几组构建成功的TR1419-CAR-T细胞亚型和抑制性分子程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）、淋巴细胞激活基因3（Lymphocyte activation gene 3,LAG-3）和T细胞膜蛋白3（T-Cell membrane protein 3,TIM-3）表达水平,并比较CAR的表达强度。（4）T细胞的干扰素-gamma（Interferon-γ,IFN-γ）检测。采用流式细胞术和酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,EIISA）检测在不同时间段不同细胞因子组合培养的活化T细胞的IFN-γ表达。（5）CAR-T细胞的杀伤功能检测。流式细胞术检测肿瘤细胞的靶抗原表达并选取表达阳性的的肿瘤细胞作为靶细胞,钙黄绿素释放试验检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。ELISA检测杀伤上清中IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B,Gzms B）的含量。（6）各组TR1419-CAR-T细胞和肿瘤细胞共孵育培养7天,流式细胞术检测CAR-T细胞的增值、亚型分化和抑制性分子表达,确定137LCK2-T是否具有更好的持久性特征。结果:第一部分:（1）我们成功构建了HER-2-CAR相关质粒并建立慢病毒转染方法,可有效制备CAR-T细胞。（2）IL-21提高了T细胞的慢病毒转染率。4组不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率无显著差异,均在15%-30%之间。4组添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率也无明显差异,均在25%-40%之间。其中,添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞均比对应的不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞有更高的慢病毒转染率。（3）IL-21调控T细胞活化早期IFN-γ的表达。实验结果发现在T细胞活化后的前6小时,IL-2+IL-21、IL-7+IL-21和IL-15+IL-21组的T细胞比对应的IL-2、IL-7和IL-15组的T细胞表达更高水平的IFN-γ。在T细胞活化的24-48小时,添加IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞比不含IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞表达更低水平的IFN-γ。最后,我们发现CD8+T细胞转染效率与其在转染时刻IFN-γ表达呈显著负相关。（4）IL-21提高了T细胞的增殖。IL-7+IL-21、IL-15+IL-21和IL-7+IL-15+IL-21组的T细胞在转染后培养12天的增殖倍数显著高于对应的IL-7、IL-15和IL-7+IL-15组的T细胞增值倍数。其中,IL-21的添加尽管提高了IL-7组的T细胞的增殖,但协同IL-7介导的T细胞增值倍数仍显著低于其他细胞因子组合培养的T细胞增殖倍数。（5）IL-21提高初始T细胞（Na?ve T,Tn）在CAR-T细胞中的比例。八组细胞因子组合培养的CAR-T细胞的亚型均以Tn为主,占比50%-80%。其中,IL-7+IL-21组的CAR-T细胞的Tn占比最高,其次是IL-15+IL-21组。而IL-2组的CAR-T细胞的Tn占比最少,其次是IL-2+IL-21组。我们还发现添加了IL-21的细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比均比对应的不含IL-21细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比更高。（4）IL-21增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。8组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞均对HER-2阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤能力并伴随着显著的INF-γ和Granzyme B的分泌。其中,添加了IL-21的细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阳性的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力和更高的效应细胞因子的分泌。几组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阴性的肿瘤细胞未表现出显著高于对照T细胞的杀伤能力和细胞因子分泌。第二部分:（1）完成了二代和半胱氨酸结构域优化的靶向TRAIL-R1的CAR质粒的构建工作,质粒测序结果和原始序列匹配。采用慢病毒转染Jurkat细胞和T细胞,均能成功转染表达CAR基因。（2）将137CAR以及优化设计的137LCK0、137LCK1和137LCK2转染Jurkat细胞,采用不同浓度的靶抗原（TRAIL-R1-Fc融合蛋白）刺激,检测几组CAR-Jurkat细胞的CD69表达,137LCK2-Jurkat在低浓度的靶抗原刺激下比其他组表达更高的CD69,因此筛选137LCK2用于后续实验。（3）28CAR、137CAR和137LCK2转染T细胞,几组CAR-T细胞的转染率均在30%-40%,且平均荧光强度无显著差异。几组CAR-T细胞的PD-1、LAG-3和TIM-3表达相当。其中,CD4+CAR-T细胞比CD8+CAR-T细胞表达更高水平的PD-1,而CD8+CAR-T细胞比CD4+CAR-T细胞表达更高水平的LAG-3和TIM-3。分析比较几组CAR-T细胞的亚型占比,均以初始T细胞（Na?ve T,Tn）为主,占比约50%,Tn在28CAR-T细胞中的比例略高于其他组。（4）采用不同浓度的靶抗原刺激几组CAR-T细胞,几组CAR-T细胞的CD137表达随靶抗原浓度的降低表达下降,其中137LCK2-T细胞在多种靶抗原浓度刺激下均比137CAR-T表达更高的CD137,而其他几组CAR-T细胞未表现出显著差异。我们根据肿瘤细胞表面TRAIL-R1的表达水平,选择HS578-T、和SW480作为杀伤试验的靶细胞,三组CAR-T细胞均能有效杀伤表达TRAIL-R1的肿瘤细胞,且三组CAR-T细胞对HS578-T和SW480的杀伤率无明显差异。（5）几组CAR-T细胞在靶抗原的刺激下培养7天后,几组CAR-T细胞均是以Tn为主。其中CD4+CAR-T细胞以中央记忆性T细胞（Central memory T,Tcm）为主,CD8+CAR-T细胞中以Tn为主。效应记忆型T细胞（Effect memory T,Tem）和效应T细胞（Effect T,Te）在几组CAR-T细胞中的比例无显著差异。同时,在137LCK2细胞中,有更多的Tn分化成Tcm。另一方面,CD4+137LCK2-T和CD8+137LCK2-T细胞的增殖速率均明显高于其他组的CAR-T细胞,且137LCK2细胞表达更低的LAG-3。结论:一方面,我们发现IL-21提高T细胞的慢病毒转染效率,并调控T细胞活化早期IFN-γ的表达,且IL-21对T细胞IFN-γ表达的调控可能是其提高慢病毒转染率的部分原因。我们证实IL-21提高了低分化CAR-T细胞的富集和扩增,增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。另一方面,我们通过在CAR的胞内段连接一段特定半胱氨酸序列模拟CD4/CD8共受体在T细胞活化信号转导中的作用,该优化方式提高了CAR-T细胞对靶抗原的灵敏度,增强了CAR-T细胞在靶抗原刺激下的增殖,促进了CAR-T细胞的Tcm分化,且降低了抑制性分子LAG-3的表达。本实验通过对CAR-T细胞的制备过程和CAR机构的优化为CAR-T细胞抗肿瘤治疗提供了新策略。