白菜(Brassica campestris)浸花法转基因技术研究

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白菜(包括结球白菜和不结球白菜)在亚洲特别是中国、日本和韩国是最重要的蔬菜。白菜的生产过程易受虫害侵扰,且需水量大。通过基因工程导入外源基因,可以创造出白菜的新种质,进而从根本上改变白菜种质资源。  农杆菌介导的浸花(floral-dip)转化方法是近年发展起来的一种较简便的不依赖组织培养的转基因方法。该方法的优点在于可以避开组织培养和继代培养,直接获得转基因的种子,而且相对于真空转化,对仪器设备要求较低。因此,该转化方法适用于难以进行组织培养和离体再生的植物。本研究以携带 pBBB-intron-gus质粒的农杆菌C58为转化用工程菌,对5个结球白菜品系(08-1083-2,08-1084-2,02-311,02-507,06-940)和不结球白菜四九菜心进行农杆菌介导的浸花转化,以期为探索功能基因导入白菜活体的方法提供一定的理论根据。其中大白菜品系08-1083-2收获了14棵抗性株,经鉴定后证明没有获得转化株,不结球白菜四九菜心获得4棵抗性株,GUS检测为非真实转化株。  为了进一步探讨农杆菌通过浸花处理难以进入白菜花器官的可能原因,对拟南芥和四九菜心两种材料不同发育阶段的花蕾进行形态及解剖观察,以研究二者在花发育节律及形态结构上的差异。结果显示,两种材料均是幼嫩子房时成开口杯状,随着花蕾长大,心皮逐渐闭合;调查新生花蕾在花序总花蕾中所占的比例,四九菜心为20%,而拟南芥高达62.6%;综合形态及解剖观察结果,可以推断花蕾期心皮闭合至开花的时间,四九菜心约为15天,而拟南芥仅需3天。有研究指出,开放的心皮形成的孔道可能是是农杆菌进入供试材料体内的途径之一,而浸花法转化发生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推断,过早闭合的心皮可能是造成农杆菌不能顺利进入四九菜心的原因之一,而新生花蕾占总花蕾比例较低造成四九菜心转化率的降低。  为了证实这一推测,本研究对不结球白菜引心360和拟南芥进行了平行浸花实验,分析供试材料花器官中农杆菌数量的差异,试图阐释白菜转化率低的原因。首先以含0.225g/L ppt除草剂 Basta的溶液喷施处理株收获的种子,对照材料获得了抗性株(3株),其植株转化率为20%,而引心360没有获得抗性株。GUS检测证明拟南芥抗性株中外源基因得以表达。然后采用细菌平板培养法,研究处理材料花蕾内农杆菌的数量差异。结果表明,在浸花处理后的6天内,在添加拟南芥花蕾提取物的筛选平板上,仍能培养出60-900的菌落数(s/g),而在加白菜花蕾提取液的平板上,菌落形成单位为0。这说明农杆菌很难通过浸花处理进入白菜花器官内,在一定程度上解释了为何白菜的转化频率远远低于拟南芥。
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