文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)是无患子目(Sapindales)无患子科(Sapindaceae)文冠果属(Xanthoceras)的多年生灌木,其种仁含油量在60%以上。文冠果种仁中除含油脂外,还含有丰富的生物活性物质,如黄酮类、三萜皂苷类、香豆素类、甾醇类等,具有极高的开发利用价值。近年来,将文冠果油作为高端食用油或者生物柴油原料的研究很多,也实现了商品化销售。但由此而产生的文冠果种仁饼粕利用率非常低,几乎都作为肥料或者废弃物丢弃,造成极大浪费。而研究证明,文冠果饼粕中所含的皂苷类物质有很多生物活性,如抗HIV、降血脂血糖、抑菌等作用,具有很好的应用前景。本研究以榨油后的文冠果种仁饼粕为原料,经脱脂后提取文冠果种仁总皂苷,纯化后利用MS及HPLC-ESI-MS等方法分析鉴定其基本组成;在此基础上,采用体外细胞实验探索皂苷的抗肿瘤活性,并进一步明确其抗肿瘤活性的分子机制。主要研究结果如下:(1)从脱脂的文冠果种仁饼粕中提取、纯化、分离出的总皂苷含量为93.5%,液质联用分析等鉴定总皂苷的组分主要有以下8种:即文冠果皂苷B(化合物1)、3-0-(3-O-a-L-arabinofuranosyl-2-O-β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucuronopyranosyl-21,22-di-O-angeloyl-Ri-barrigenol(化合物 2)、16-O-acetyl-21-O-(4-O-angeloyl)-a-L-rhamnopy ranosyl-barringtogenol C(化合物 3)、28-O-β-D-glucopyranosyl-16-dexoxybarringtogenol C(化合物4)、乙酰黄芪皂苷I(化合物5)、知母皂苷BII(化合物6)、连翘酯苷B(化合物7),以及少量的非皂苷类物质杨梅素(即化合物8)。(2)选取处于对数生长期且形态良好的人肝癌细胞HepG2细胞作为试验对象,以纯化的文冠果种仁总皂苷为受试物,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响。试验发现文冠果种仁总皂苷能明显的抑制HepG2细胞增殖,且具有剂量依赖性。MTT试验显示文冠果种仁总皂苷在4 h时抑制HepG2细胞增殖效果最佳,IC50值为7.894±0.9916mg/L。同时,人肝癌细胞HepG2对文冠果种仁总皂苷的敏感性要高于正常肝细胞HL-7702。(3)利用倒置荧光显微镜观察了总皂苷处理后细胞的形态变化及AO/EB染色、DAPI荧光染色情况;结果表明,文冠果种仁总皂苷能够使HepG2细胞出现凋亡特征,即细胞变圆、间隙增大、染色质固缩、DNA片段化等。利用流式细胞仪分析了 HepG2细胞的凋亡率和周期的变化;结果发现文冠果种仁总皂苷能够诱导HepG2细胞发生凋亡,同时将细胞周期阻滞于S期;说明文冠果种仁总皂苷对HepG2的增殖抑制作用是通过阻断细胞周期和促进细胞凋亡实现的。(4)用倒置荧光显微镜观察了 JC-1荧光染色后的线粒体膜电势的变化,结果发现,文冠果种仁总皂苷处理HepG2后,其细胞线粒体膜电位下降、Bcl-2/Bax表达量下降,线粒体内细胞色素C被释放到细胞质中,caspase-3蛋白被激活,进而DNA修复酶PARP片段化,且均表现出剂量依赖性。试验说明文冠果种仁总皂苷诱导HepG2细胞的凋亡是通过线粒体介导的内源性凋亡途径实现的。(5)用Western blot法进一步研究了文冠果种仁总皂苷处理HepG2后细胞凋亡相关蛋白的变化。结果显示,PI3K/Akt信号通路可能参与了对HepG2细胞的凋亡诱导。分析认为是PI3K/Akt通路通过调节Bcl-2/Bax比值,即影响Bcl-2蛋白家族的表达来影响线粒体的结构功能完整性,从而诱导细胞凋亡。(6)利用流式细胞仪分析了 HepG2细胞的活性氧变化。发现文冠果种仁总皂苷能够刺激HepG2细胞内的活性氧的产生,下调氧化应激调控蛋白HO-1的表达水平,表明文冠果种仁总皂苷能够通过刺激细胞产生氧化应激而导致细胞凋亡。本研究较为系统的探索了文冠果种仁总皂苷诱导HepG2细胞凋亡的作用及其分子机制,对充分挖掘文冠果的作为传统医药和新型保健食品资源具有重要意义,为深度开发文冠果榨油副产物提供了理论基础。