研究背景及目的随着社会经济的快速发展以及人们饮食结构的多元化,肥胖在全球范围内的发病率呈现着逐年上升的趋势。肥胖会引起2型糖尿病、肿瘤以及心脑血管疾病等,危害公共卫生和人们的生命健康。心脑血管疾病以及肿瘤分别是现在造成人类死亡的第一以及第二位的重要因素。因而,对于肥胖的机制以及干预靶标的研究则显得尤为紧迫以及重要,除此之外还有重要的社会经济价值。脂肪组织不仅仅是机体存储脂肪以及能量的器官,更是调节机体代谢以及能量稳态的重要器官,另有学者认为脂肪组织更是一种内分泌器官。随着对于肥胖机制研究的深入,肥胖发生的炎症机制也逐渐被人们所认知,肥胖人群脂肪组织常常伴随着慢性低度炎症以及炎性细胞的浸润。研究发现,生理状态下的脂肪组织有少量的固有免疫细胞存在,并且通过分泌细胞因子招募单核巨噬细胞。基于以上的研究发现,我们也可以认为脂肪组织是免疫系统以及代谢系统的纽带,为两者之间的密切联系提供基础。肥胖相关组织的炎症反应会导致相关组织器官的胰岛素敏感性下降,组织器官胰岛素抵抗的产生会进一步加重组织代谢稳态的失衡。代谢稳态与免疫稳态息息相关,相互作用。许多的研究发现,胰岛素信号通路在炎症发生的时候会受到NF-κB信号通路的影响进而被显著抑制。肥胖所致慢性炎症反应相关的炎症信号通路的活化主要出现在胰岛素敏感的靶器官,例如脂肪组织、肝脏、骨骼肌;这也反映了炎症对于系统性胰岛素抵抗的发生有着至关重要的作用。但是,具体的代谢如何影响免疫以及免疫又如何影响代谢的机制仍不是很清楚。本研究利用Talen基因敲除技术对小鼠的全身SIRPα进行敲除,构建高脂饮食模型诱导产生肥胖及代谢综合症,从体内体外两个水平对SIRPα通过免疫调节机制影响机体代谢的作用以及机制进行研究。研究方法与结果第一部分SIRPα参与调节正常饮食条件下小鼠代谢稳态取8周大小的雄性WT与SIRPα基因敲除小鼠,利用正常饲料连续喂养18周,并且每隔一周记录小鼠体重与摄食量。观察表型,我们发现在正常饮食模型下,SIRPα基因敲除小鼠的体重增长无明显差异,小鼠摄食量亦无显著差异。通过血清生化检测,我们发现WT与SIRPα敲除突变小鼠肝功能相关指标(AST以及ALT)无显著差异。通过饥饿处理,我们观察到SIRPα基因敲除组小鼠空腹血糖水平显著高于WT组小鼠。血清胰岛素的检测发现SIRPα基因敲除小鼠的血清胰岛素含量显著高于WT组。IPGTT实验发现相比于同窝的WT组小鼠,SIRPα基因敲除小鼠在注射葡萄糖后的早期阶段血糖浓度快速升高,并且血糖降低水平明显减缓。ITT实验发现SIRPα基因敲除小鼠胰岛素敏感性低于WT组。第二部分SIRPα敲除减轻高脂诱导的小鼠胰岛素抵抗与代谢异常我们利用高脂饮食(HFD)与对照低脂饲料(LFD)喂养WT与SIRPα基因敲除小鼠。我们发现HFD喂养组中WT组小鼠体重增加显著高于SIRPα基因敲除小鼠,表明高脂饮食条件下SIRPα基因敲除小鼠的代谢可能存在一定程度改善。进一步,我们检测HFD与LFD喂养条件下WT组与SIRPα基因敲除组小鼠血清生化以及代谢的相关指标。结果发现HFD组SIRPα基因敲除小鼠ALT、血清甘油三酯(TG)与血清胆固醇(TC)水平显著低于WT组小鼠,AST无显著差别,以上结果提示SIRPα基因敲除组小鼠代谢指标改善。除此之外,通过IPGTT实验发现HFD处理中SIRPα基因敲除组小鼠糖耐量较WT组改善。ITT实验表明SIRPα基因敲除组小鼠胰岛素敏感性优于WT组。通过以上结果,我们发现高脂饮食条件下SIRPα敲除组小鼠糖代谢与胰岛素敏感性有显著改善。第三部分SIRPα影响小鼠的能量以及脂质代谢我们通过代谢笼的方法检测正常饮食与高脂饮食条件下WT组与SIRPα基因敲除组小鼠摄食活动以及能量利用率的差异。发现正常饮食条件下WT组小鼠的活动率(Activity)水平高于SIRPα基因敲除组小鼠。同时我们发现WT组小鼠24小时的氧气消耗量与二氧化碳呼出量均较SIRPα基因敲除组小鼠有所增加。高脂喂养组中,WT组小鼠的活动率低于SIRPα基因敲除组。相较于正常饮食组,高脂饮食条件下WT小鼠的整体活动率降低,而SIRPα基因敲除组小鼠无显著差异。同时我们发现高脂喂养条件下组WT小鼠24小时的氧气消耗量与二氧化碳呼出量均较SIRPα基因敲除组小鼠有所减弱。以上结果提示高脂饮食条件下SIRPα敲除组小鼠能量利用率高于WT组,与SIRPα敲除组代谢指标改善的结果一致。高脂喂养条件下,WT组肝脏体积明显大于SIRPα基因敲除组,且肉眼可见颜色发白。进一步研究发现WT组肝脏重量、肝体比均显著高于SIRPα基因敲除组。WT组肝脏甘油三酯的水平亦高于SIRPα基因敲除组。通过定量PCR检测发现正常饮食条件下WT组与SIRPα基因敲除组小鼠肝脏脂肪酸合成代谢的相关基因如Acc1、Chrebp、Srebp2、Fasn、Acly、Pparg等水平无显著差异。脂肪组织定量分析发现高脂饮食条件下WT组小鼠脂肪组织重量高于KO组小鼠。将脂肪组织按照部分进行区分发现,高脂饮食条件下WT组小鼠附睾脂肪组织(EAT)、肾周脂肪组织(PAT)、肠系膜脂肪组织(MAT)、皮下脂肪组织(SAT)的重量均高于SIRPα基因敲除组小鼠,而棕色脂肪组织(BAT)的重量与SIRPα基因敲除组无显著差别。通过定量PCR检测发现正常饮食条件下WT组与SIRPα基因敲除组小鼠脂肪酸从头合成关键基因的表达水平无显著差异。高脂饮食条件下,相比于WT组,SIRPα基因敲除组小鼠脂肪酸从头合成基因表达水平降低。检测了高脂饮食条件下小鼠BAT的产热基因表达水平,我们发现SIRPα基因敲除组小鼠BAT相关产热基因Ucp1、Pparg、Prdm16、Cox7a1的表达水平高于WT组,提示SIRPα基因敲除组BAT的产热能力高于WT组。HE染色发现高脂饮食条件下WT组WAT与BAT组织脂肪细胞体积显著高于SIRPα基因敲除组。免疫组化染色发现BAT组织中SIRPα基因敲除组UCP1的表达水平显著高于WT组。以上结果提示SIRPα敲除抵抗高脂诱导的脂类新生,促进BAT组织产热基因的表达。糖原PAS染色结果显示,正常饮食条件下,相比于WT组,SIRPα基因敲除组小鼠肝脏内糖原显著累积。Glycogen定量检测试剂盒检测肝脏组织内糖原含量,我们发现相比于WT组小鼠,SIRPα基因敲除组小鼠肝脏内的糖原含量明显增加。定量PCR结果显示,正常饮食条件下SIRPα基因敲除组小鼠的糖原代谢相关基因Gsy、Gbe(glycogen-branching enzyme)、GP(glycogen phosphorylase)中Gsy表达水平显著上调。另外,定量PCR检测糖异生通路中关键酶基因的表达,结果显示相比WT组,SIRPα基因敲除组小鼠的糖异生水平显著升高。高脂饮食条件下,PCR定量检测的结果显示,WT组以及SIRPα基因敲除组小鼠糖异生通路中关键酶基因的表达量没有显著差异。然而,检测糖原代谢相关的基因的表达,我们发现相较于WT组,SIRPα基因敲除组小鼠的糖原合成以及分解均出现上调。我们发现高脂饮食下的肝脏糖原相较于正常饮食组出现了显著的升高,这与高脂模型所致的糖原累积一致,不过WT组和SIRPα基因敲除组小鼠的肝脏糖原定量差异减小。第四部分SIRPα参与调节正常饮食与高脂饮食条件下的小鼠免疫状态HE染色发现SIRPα基因敲除组小鼠肝脏组织存在较多炎性细胞浸润。荧光定量PCR检测发现正常饮食条件下SIRPα基因敲除组小鼠肝脏组织中炎性因子Ifng、Tnfa等表达水平显著高于WT组,而抑炎因子IL4、IL13、IL10等表达水平低于WT组。F4/80染色显示SIRPα基因敲除组小鼠肝脏中巨噬细胞的分布密度显著高于对照组。ELISA检测验证SIRPα基因敲除组肝脏组织中IL6、TNFα表达水平较高。以上结果提示正常饮食条件下敲除SIRPα促进小鼠肝脏炎症。同样的检测了高脂模型下小鼠的炎症相关指标,HE染色显示高脂饮食下WT组小鼠肝细胞脂肪变性程度高于SIRPα基因敲除组,这与WT组肝脏脂肪累积增多的结果相一致。免疫组化染色显示WT组F4/80阳性巨噬细胞的分布密度高于SIRPα基因敲除组。定量PCR检测发现WT组小鼠肝脏炎性因子的表达水平高于SIRPα基因敲除组。与此相一致的,SIRPα敲除抵抗高脂诱导的胰岛素抵抗。以上结果提示高脂饮食下SIRPα敲除抑制肝脏炎症状态。脂肪组织炎症与脂质代谢与脂肪细胞新生等相关,我们随后检测不同代谢状态下脂肪组织免疫状态。与肝脏组织类似,我们发现正常饮食条件下SIRPα敲除促进脂肪组织髓系细胞浸润与加重脂肪组织炎症,高脂饮食下SIRPα敲除抑制脂肪组织炎症状态。结论根据以上结果并结合四部分的内容,可以总结得到:1、SIRPα敲除会影响正常饮食下小鼠的代谢以及免疫稳态,主要表现为糖代谢的异常以及血清胰岛素水平升高,同时肝脏以及脂肪组织的炎症显著加重表现为促炎因子的表达上调以及抑炎因子的表达下调。2、在高脂饮食构建的肥胖模型中,我们观察到截然不同的表型,主要表现为体重的下降、糖代谢的改善、血清胰岛素的下降以及组织炎症的减轻。3、代谢笼的结果提示,正常饮食下SIRPα敲除会抑制小鼠的能量利用率。相反的,高脂饮食下SIRPα敲除小鼠的能量利用率反而相较对照组显著升高。