论文部分内容阅读
乌头类生物碱是毛莨科乌头属植物的主要成分,具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、强心等药理作用,同时也是毒性成分。因此,该类药材使用前必须经过严格的炮制和检验,否则极易引起中毒甚至死亡事件的发生。为保证上述药材及其制剂药用安全性,需要完善的检测方法作为保障,而检测方法的建立也需要高纯度的乌头类生物碱标准品作为前提条件。本论文首先对乌头类生物碱标准品的分离纯化方法进行了研究,在此基础上对包括中药材、中成药、血浆及尿液在内的不同基质中乌头类生物碱的检测方法进行了研究,以期为乌头属药材及其制剂质量控制、乌头类生物碱毒理学、法医学和药代动力学研究提供新的检测方法。首先研究了利用高速逆流色谱同时分离附子中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱三种主要单酯型生物碱的方法。使用制附子乙醇粗提物作为分离样品,考察了不同的溶剂体系、主机转速、流动相流速对分离结果的影响。最终选用氯仿-甲醇-正丁醇-HCl水溶液（4:1:1:5,v/v）的四元溶剂体系,主机转速800 rpm,流动相流速4.0 m L/min。在此条件下,三种乌头类生物碱在200min内全部基线分离,得到的三个化合物纯度分别为98.2%、98.0%、98.8%。该分离方法具有样品回收率高、制备量大、节省溶剂、操作简单、快速等优点,为本文后续乌头碱成分检测方法的研究提供了标准物质。针对于中药材附子中乌头类生物碱的检测,本文建立了离子液体双水相提取-高效液相色谱测定附子中六种乌头类生物碱含量的方法。附子样品经离子液体水溶液超声提取后,加入无机盐形成双水相系统,乌头类生物碱被富集到上层离子液体相中,直接注入高效液相检测。通过考察不同的离子液体双水相体系、离子液体用量、无机盐用量、pH值、提取时间等因素对提取率的影响确立了最佳提取条件。在此条件下方法的加样回收率范围为80.37107.18%,RSD值范围为2.134.87%。与传统提取方法相比,该方法具有消耗的试剂和样品量少,耗时短,灵敏度高的优点。鉴于离子液体双水相在乌头类生物碱提取方面的优异性能,本论文还研究了利用离子液体双水相结合有机溶剂反萃取和非有机溶剂反萃取制备乌头类生物碱提取物的方法。考察了氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷四种有机溶剂对离子液体相中乌头类生物碱的反萃取率。结果显示,除去正己烷之外的三种有机溶剂的反向萃取率都比较高,一次萃取率在75%以上;非有机溶剂反萃取的方法是通过原位置换反应使亲水型离子液体转化为疏水型离子液体,利用含酸水溶液反向萃取离子液体中乌头类生物碱,虽然过程比较复杂,但具有反萃取过程中不使用挥发性有机溶剂的优点。针对常用中成药小活络丸中双酯型乌头类生物碱含量低、基质复杂的特点,本论文研究设计了气体辅助离子液体分散液液微萃取和离子液体均匀液液微萃取结合高效液相色谱检测小活络丸中三种双酯型乌头类生物碱含量的方法。通过考察离子液体的种类及用量、pH值、充气时间对萃取率的影响确立气体辅助离子液体微萃取方法的最佳条件。同时,通过考察置换剂的种类及用量、离子液体用量、pH值对萃取率的影响确立离子液体均匀液液微萃取方法的最佳条件。在此条件下,两种方法的回收率范围分别为85.8394.44%和81.6793.06%。气体辅助离子液体分散液液微萃取方法拥有更好的回收率且离子液体用量更少。利用该方法结合高效液相检测了不同厂家生产的小活络丸中三种双酯型乌头类生物碱的含量。结果显示,三个厂家生产的小活络丸中双酯型乌头类生物碱的含量有一定差别,但总量都比较低。在上述研究基础上,本论文还对生物样品,包括血浆与尿液中乌头类生物碱的检测方法进行了研究。针对血浆样品黏度大,蛋白质、脂肪等干扰物质多的特点,本文建立了基质固相分散-涡旋辅助分散液液微萃取结合高效液相色谱检测血浆中六种乌头类生物碱含量的方法。通过考察固相分散剂、洗脱剂、萃取剂、盐浓度、pH值等因素对回收率的影响确立了最佳实验条件。在此条件下六种乌头类生物碱的加样回收率范围为73.81101.82%,RSD值范围为2.356.56%。该方法能有效去除血浆中干扰基质对目标分析物的影响,同时具有较高的灵敏度,适用于血浆中痕量乌头类生物碱的检测。针对尿液样品黏度低、蛋白质含量相对较少的特点,本文建立了泡腾辅助离子液体分散液液微萃取磁性纳米粒子吸附结合高效液相色谱测定尿液中多种乌头类生物碱含量的方法。本方法将冰醋酸与微量离子液体及纳米Fe3O4低温下凝结成冰片,加入到溶有Na2CO3的尿液中,生成的CO2使离子液体分散的同时增加目标分析物与离子液体的接触面积。泡腾结束后利用外部磁铁分离吸附在Fe3O4磁性纳米粒子表面的离子液体。通过考察泡腾剂的组成、离子液体的种类及用量、磁性纳米Fe3O4用量、解吸剂等多种因素对回收率的影响确立了最佳实验条件。在此条件下六种乌头类生物碱的加样回收率范围为81.11106.67%,RSD值范围为2.706.49%,表明方法的加样回收率良好,可以应用于尿样中痕量乌头类生物碱的检测。综上,本论文首先研究了快捷高效的制备乌头类生物碱标准品的方法;其次针对不同的样品特点研究设计了多种液相微萃取方法,结合高效液相色谱建立了不同基质的药物及生物样品中乌头类生物碱的绿色分析方法,同时为中药药效物质的分析检测与质量控制提供了新的研究思路。