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本研究选用从四川某养殖场分离的两株鸭金黄色葡萄球菌DS12、DS13和三株鸭多杀性巴氏杆菌D22、D23和D157为制苗菌株,采用固体表面培养法,以蜂胶为免疫佐剂,制备鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗。该疫苗物理性状符合疫苗制作的基本要求,经安全性检验证明其安全可靠;通过筛选确定了该疫苗的最佳免疫剂量为5×10~9CFU/mL,0.5ml/只,4℃可保存12个月以上。本研究建立了检测鸭金黄色葡萄球菌抗体和鸭巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法,对制备的鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌(P.multocide-S.aureus)二联蜂胶灭活疫苗的体液免疫应答进行研究。采用鸭巴氏杆菌、葡萄球菌全菌裂解抗原为包被抗原,建立检测P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗免疫后的鸭血清中特异性抗体的ELISA方法。确定了金黄色葡萄球菌抗原最佳包被浓度:DS12最佳包被浓度为5.5μg/mL,DS13最佳包被浓度为6.25μg/mL;巴氏杆菌抗原最佳包被浓度:D22最佳包被浓度为11μg/mL,D23最佳包被浓度为17μg/mL,D157最佳包被浓度为16μg/mL。酶标羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.125μg/mL。经交叉试验,重复性试验证实建立的ELISA重复性好、特异性强。板内变异系数分别为1.71%-4.06%(金黄色葡萄球菌)、1.93%-3.55%(巴氏杆菌),板间变异系数分别为1.82%-4.18%(金黄色葡萄球菌)、1.96%-4.75%(巴氏杆菌)。包被金黄色葡萄球菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍,包被巴氏杆菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍。应用建立的ELISA方法对该疫苗的体液免疫应答进行研究。结果表明,注射了P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗后,试验鸭在第3d开始产生免疫力,P.multocide和S.aureus共5株菌的抗体水平随着时间的延长逐渐升高,并在免疫后26d左右达到抗体最高水平,然后逐渐下降,免疫后75d的抗体水平与免疫后两周的抗体水平相当。且在免疫后的3-75d,一次免疫组的特异性抗体水平极显著高于生理盐水对照组(P＜0.01),二次免疫组的特异性抗体水平于一次免疫后9d开始显著高于一次免疫组(P＜0.05),于12-75d极显著高于一次免疫组(P＜0.01)。攻毒保护试验结果表明,该疫苗对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌同源菌株的攻击有保护力,一次免疫后14d,对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为90%和70%,二次免疫后14d,对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为100%和80%。采用MTT比色法对T淋巴转化试验进行研究,试验结果表明,一次免疫组从免疫后的3d起,鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应增强,明显高于对照组,到第9d时达到峰值,然后迅速下降。二次免疫组于免疫后第9-12d时,鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应较强,且与一次免疫组差异极显著(P＜0.01),第19d时,二次免疫组和一次免疫组差异显著(P＜0.05)。免疫后3-19d,一次免疫组和对照组差异极显著(P＜0.01);免疫后26-33d,一次免疫组、二次免疫组和对照组,差异均不显著。本研究表明,巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗安全、有效、无副作用,能够刺激机体迅速产生细胞免疫和体液免疫应答。