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骨骼肌是动物体内最丰富的组织,约占动物体重的40%,其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状之一。另一方面,中外猪种在生长速度,肉质等方面存在着较大的差异,大量研究证实这种差异的形成与基因的差异表达有关。为了更好的揭示形成该差异的分子机理,更好的认识骨骼肌的发生发育机理,我们采用抑制消减杂交(SSH)方法构建了梅山—大白猪背最长肌正反向抑制消减杂交文库。并对差异表达基因进行了进一步的筛选和分子生物学特征分析,结果如下:1.用GAPDH和β-actin分别作为检测指标,对梅山猪与大白猪背最长肌正反向消减cDNA文库的消减效率进行检测,消减前后看家基因循环数均相差10个循环以上。说明构建的消减cDNA文库质量较好,可以满足后续工作的需要。2.将所获得的差减cDNA片段连接到pGEM-T克隆载体中,分别得到含有近3000(大白)和2500(梅山)个克隆子的质粒文库。经PCR检测,有效单克隆分别为2739和2109个,阳性率分别为91.3%,84%,其插入cDNA片段大小在0.2-1.2kb之间。3.对消减cDNA文库分别进行斑点杂交验证,阳性率为25%。分别从经斑点杂交筛选过的大白、梅山消减文库中挑选出350个和280个阳性克隆进行测序。测序结果经BLAST软件分析,共代表120个已知基因。其中,以大白为Tester的消减文库中得到的有效序列为313个,合并成101个contigs,代表70个已知基因,5个未知基因和4个全新EST。以梅山为Tester的消减库中得到的有效序列有237个,合并成97个contig,50个已知基因,11个未知基因和5个全新EST。4.经过比较发现,大白消减文库中含糖代谢途径相关的基因较多,而梅山消减文库中线粒体编码的基因较多。5.采用SYBR Green荧光染料法,以HPRT作为内标对其中的部分基因进行了进一步的Real-Time RT-PCR验证。6.对差异表达基因丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)进行进一步的分析。经斑点杂交和半定量RT-PCR验证,发现该基因在四月龄梅山猪中较高水平表达。(1)对PDK4检测其在大白,梅山中不同发育阶段(胚胎65天,出生后3天,5周龄,2月龄,4月龄,6月龄)的表达量,发现其具有相似的表达趋势,其中,在初生(3天)时的表达量最高,之后逐渐降低,到3周龄时表达明显下降,至5周龄达到最低,之后在梅山中又有所上升,但在梅山4月龄和6月龄表达量都较低。(2)比较各阶段大白,梅山之间的表达发现,梅山在胚胎期,出生后3天,5周龄,2月龄,4月龄都显著高于大白,在6月龄时大白猪中的表达量略高于梅山。(3)对其进行了组织表达潜分析,结果显示,其在骨骼肌中的表达量较高,在脂肪中的表达量较低。(4)结合电脑克隆和RACE技术,成功克隆得到其全长共3589bp和第四(162bp),九(299bp),十(1696bp)内含子序列。并对其进行了序列分析和进化树分析。发现该基因与牛亲缘关系较近,与鸡,爪蟾亲缘关系较远。(5)多态性分析:对第九内含子中的一个G/A突变位点用PCR-SSCP的方法在实验室2003,2004年建立的大梅F2代资源家系311个个体中分析并与其相应生产性状进行关联,结果显示,该位点与至第一肋胸、瘦肥肉比例、失水率、系水力、LD肌肉色值、脂肪含量、水分含量等性状有显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)相关。(6)克隆得到长约2.3kb长的启动子序列,通过序列分析,发现上面有很多跟肌肉发育相关的转录因子结合位点。通过与人比对发现,其中的一段与人的相似性高达70%,为相对保守序列,推测该段序列在该基因的表达中起着重要的作用。7.对前期实验室筛选的一个亲代大白和子代长大猪肌肉组织差异表达EST基础上克隆了基因ERBB2转换子1(TRANSDUCER OF ERBB2,1,TOB1),并对其进行了进一步的分析。(1)结合电脑克隆和RACE技术,以大白背最长肌SMART cDNA为模板,克隆得到其mRNA全长共2263bp。其中CDS 1044bp,编码347aa。对其3’UTR区分析发现,该基因的3’UTR区域存在多个AU序列(ATTTA),该序列与基因的快速降解(稳定性)有关,表明该基因是属于早期应答基因,在体内起调控作用。(2)对其进行了进化树分析,发现该基因与灵长类亲缘关系较近。(3)通过四品种TOB1基因对应蛋白序列比对,发现了六处氨基酸的改变。(4)对该基因在四月龄大白,梅山中的RNA表达水平进行分析比较,发现该基因在四月龄梅山猪中的RNA表达量高于大白猪。(5)比较TOB1基因在大白,梅山各发育阶段的RNA表达水平,发现其在梅山各阶段的表达量都明显高于大白。且变化趋势相似。即从胚胎65d到6月龄表达量逐渐升高,但在两月龄中表达量较低。(6)对其进行了组织表达谱分析,结果显示,其在骨骼肌中的表达量较高,在脂肪中的表达量较低。