乌苯美司是一种新型抗肿瘤药物。它是Umezawa等（1976）在橄榄网状链霉菌（streptomyces olivoreticuli）培养上清液中分离出的一种低分子量二肽化合物（分子量为308.38道尔顿）。化学名为N－[（2S，3R）－4苯基－3－氨基－2－羟基丁酰]－L－亮氨酸，商品名为百士欣。近年来的体外实验及临床验证结果表明，乌苯美司与其他化疗药物联合使用，能显著延长成人急性非淋巴细胞性白血病患者的生存期和缓解期。对其他恶性肿瘤如：肺鳞癌、胃癌、鼻咽癌、膀胱癌等癌症均有明确疗效。由于其抗肿瘤机制与常用的抗癌药物可能不同，以及其较强的免疫调节功能，可能为临床对耐药病例的治疗开创新的方法。 最初观察到的乌苯美司生物活性是对细胞膜表面的氨基酸肽酶B、N和亮氨酸氨基肽酶的抑制作用。进一步的研究认为它具有多种有效的免疫学活性，其中包括T淋巴细胞的刺激、巨噬细胞的激活、骨髓干细胞刺激等。近年来发现其具有直接的抗肿瘤活性，其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。已有体外研究表明乌苯美司可诱导人非小细胞肺癌细胞、人白血病细胞等凋 2001年浙江大学硕士学位论文 亡。但在对滋养细胞肿瘤作用的报道较少，尤其是关于乌苯美司对绒癌细胞 的凋亡作用国内外均未见报道。 本实验以人绒癌细胞株 JAR为受试对象，用乌苯美司 5种浓度（250wt。 500wt、1000wt、150（）w、2000wt）及 4种作用时间（24小时、48 ’J’时、72小时、96小时），从3个方面观察乌苯美司对绒癌JAN细胞的杀伤 作用：＊）通过相差显微镜观察活细胞贴壁程度、细胞形态改变；（佣MTh 法测定细胞抑制率，观察乌苯美司浓度、作用时间与杀伤作用之间的关系；（3） 通过时间分辨荧光兔疫法测定hCG，观察不同浓度的乌苯美司对JAR细胞合 成和分泌hCG的功能的影响。细胞凋亡的观察是从3个方面进行：＊）通过 透射电镜和扫描电镜，分别观察细胞内部结构和细胞表面结构的凋亡形态学 改变；（2）细胞凋亡的生化基础是DNA在核小体间特异性的断裂，其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用 PI染色后分析，可在二倍体 GO／GI期峰前 出现一亚二倍体峰即凋亡峰up峰），根据Ap峰的高低可测出凋亡细胞百 分率。本研究用流式细胞仪测定乌苯美司作用后的JAN细胞凋亡峰及细胞周 期分布的改变；（3）应用分子生物学方法——脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导 的缺口末端标记法（termnal－deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeliap，TUNEL），特异性标记凋亡后形成的DNA片段，原位检测凋亡细 胞。 结果表明，（）加入药物 24h可观察到少量死亡细胞。48h～72h时细胞表 现为体积缩小，胞膜皱缩，细胞间隙变宽，细胞分离，贴壁程度下降，漂浮 于培养基中。随着药物浓度的增高，死亡的细胞数增加。细胞形态多为圆形， 或不规则形。（2）MTT细胞活力分析显示实验组细胞生长抑制率明显高于对 照组，且随着乌苯美司作用时间和浓度的增加而增加。线性回归与相关性分 析显示，作用24小时、48小时、72小时、96小时，药物浓度与细胞生长抑 制率呈显著相关性什分别为0．965、0．992、0．987、0．982，p＜0．05），IC。。分 －2－ 2001年浙江大学硕士学位论文别为933渺、692…L、slZwt、427炒，呈递减趋势。细胞生长抑制率与作用时间也呈显著相关性＊分别为0．950、0．993、0．990、0．983、0，960，r刀．05）。（3）乌苯美司作用24小时后，JAR细胞分泌hCG量有明显下降，经方差分析5个浓度组的h＊G量与对照组之间有显著性差异（p＜O．05），而各浓度组之间无显著性差异（poo．05）。（）透射电镜观察到乌苯美司作用后JAR细胞染色质凝集、边聚，核膜皱缩，胞质凝缩，细胞器电子密度增高，数量增多，如线粒体、内质网及大小泡等，并发生融合。胞膜完整，细胞核固缩成均一的致密物，形成有膜包被的典型的凋亡小体。扫描电镜观察到经乌苯美司处理后的JAR细胞大部分体积明显缩小。细胞表面微绒毛减少或消失。细胞膜仍完整。（5）乌苯美司处理JAR细胞后，经流式细胞仪检测，其相关参数由 LysiSll软件自动分析处理，在 DNA直方图上 GO／GI期前均出现一个峰型，即凋亡峰（Ap）。细胞凋亡率随着浓度而递增。低中浓度细胞 GO／GI期有阻滞。间