慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）是起源于造血干细胞的克隆增殖性恶性血液病,90%以上CML患者出现9号和22号染色体易位形成Ph染色体和bcr/abl融合基因,此基因进一步转录合成具有高度酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白,干扰造血干/祖细胞发育的信号转导过程,它是CML Ph染色体阳性细胞逃避正常细胞增殖和凋亡调控系统,不断增殖并产生凋亡耐受及大量进入外周血的根本原因。CML的主要特征为细胞过度增殖、凋亡受抑、粘附及迁移功能异常。2-甲氧基雌二醇（2-Methoxyestradiol, 2-ME）为内源性雌激素代谢产物,2-ME对雌激素受体的亲和力较低,因此似乎并不是通过影响雌激素受体通路而起作用。2-ME抗肿瘤作用主要是通过抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞和内皮细胞凋亡、细胞周期停滞、抗血管新生及增强肿瘤细胞对辐射的敏感性而实现的。由于该药只对增殖活跃的细胞有作用,而对静止细胞无作用,因而不良反应较小,故近年来日益受到重视。迄今为止,尚无2-ME对白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期及粘附功能影响的研究报道,国外仅有2-ME对CML细胞生物学影响的零星报道,但无2-ME对CML细胞L-选择素及bcr/abl基因表达影响的报道,我们采用新型抗肿瘤化合物2-ME体外研究对bcr/abl（+）CML急变期细胞系K562细胞增殖、细胞周期、凋亡及粘附功能的影响,并探讨其作用机制,为2-ME的临床应用提供某些实验依据,进而为CML的靶向治疗开辟一条新途径。本研究分为如下四个部分。第一部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞增殖及细胞周期的影响目的:研究2-ME对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞增殖及细胞周期的影响。方法:（1）实验分组:取对数生长期的K562细胞随机分为二组:①对照组:培养基中不含2-ME;②实验组:分别用1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L及16μmol/L浓度的2-ME处理K562细胞24h、36h、48h及60h后观察各项指标的变化。（2）细胞形态观察:倒置相差显微镜下观察各实验组细胞形态变化,于2-ME作用36h、形态学变化最显著时拍摄记录细胞形态。（3）四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定2-ME对细胞增殖的抑制作用。（4）流式细胞术（FCM）检测2-ME对K562细胞周期分布的影响。结果:（1）细胞形态变化:2-ME1μmol/L浓度组整个时间段细胞形态变化不明显;2μmol/L浓度组于36h可见少许细胞变形、坏死,随着时间的延长变形、坏死的细胞有增多趋势;4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L浓度组24h即可见细胞变形、核固缩、核碎裂和胞膜突起等现象,这种变化与2-ME浓度及时间呈正相关趋势。（2） 2-ME对K562细胞增殖的影响:2-ME对K562细胞的生长抑制率各组之间均有显著性差异（P<0.01）。2-ME在1μmol/L⁸μmol/L浓度范围内,对K562细胞的生长抑制率随浓度增高而逐渐增加,至16μmol/L时,细胞抑制率增加不明显;在24h⁴8h时间范围内,2-ME对K562细胞的生长抑制率随时间延长而逐渐增加,至60h时细胞抑制率无明显增加,提示在一定浓度和时间范围内,2-ME以时间-剂量依赖的方式抑制细胞生长。（3） 2-ME对K562细胞周期的影响:在一定浓度范围（0⁴μmol/L）内,随着2-ME浓度的增加,G0/G1期细胞逐渐增多,S期细胞逐渐减少,但2-ME浓度>4μmol/L后G0/G1期细胞比例不再增加。2-ME浓度为4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L三组的G0/G1期细胞比例与对照组比较有统计学意义（P<0.05）。结论:2-ME在一定的浓度和作用时间范围内,以剂量-时间依赖形式抑制K562细胞生长,细胞出现变形、核聚集、核碎裂和胞膜突起等形态改变。随着2-ME浓度增加和作用时间延长,处于G0/G1期的K562细胞比例逐渐增加,S期细胞逐渐减少。总之,2-ME在一定范围内呈时间和剂量依赖性抑制K562细胞增殖、阻滞K562细胞周期异常运行。第二部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞凋亡及凋亡相关分子表达的影响目的:研究2-ME对白血病K562细胞凋亡的影响,并从凋亡相关分子Caspase-3和XIAP的mRNA及其蛋白的水平探讨2-ME诱导K562细胞凋亡的某些机制。方法:（1）原位细胞凋亡法（TUNEL）检测K562细胞凋亡率。（2） FCM检测K562细胞凋亡率。（3） FCM检测K562细胞凋亡相关分子Caspase-3及XIAP蛋白表达。（4）半定量RT-PCR检测K562细胞Caspase-3及XIAP基因的表达。（5）黄嘌呤氧化酶法检测K562细胞超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）水平。结果:（1） K562细胞凋亡率:实验组经K562细胞与2-ME分别处理36h后,应用TUNEL法染色,显微镜下观察凋亡细胞较对照组明显增多。计算凋亡率结果显示,2-ME浓度为1μmol/L时,凋亡率未见明显增加,之后随着2-ME浓度增加,K562细胞凋亡率逐渐增加,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。2-ME浓度至16μmol/L时,细胞凋亡率有所下降;应用FCM检测K562细胞凋亡率,得到相似结果。两种方法测得的K562细胞凋亡率呈正相关（γ=0.845,P=0.034）。（2） FCM检测K562细胞凋亡相关蛋白表达:随着2-ME浓度增加,Caspase-3蛋白表达逐渐增加,与对照组比较均有显著性差异（P<0.05）;而随着2-ME浓度增加,XIAP蛋白表达逐渐降低,但与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3）半定量RT-PCR检测K562细胞凋亡相关基因表达:随着2-ME浓度增加,Caspase-3基因表达逐渐增加,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）;而随着2-ME浓度增加,XIAP基因表达逐渐降低,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。Caspase-3与XIAP基因表达量之间呈负相关（γ=-0.966,P=0.000）。（4） 2-ME对K562细胞SOD与ROS的影响:随着2-ME浓度增加,SOD活性逐渐降低,ROS活性逐渐增加,与对照组比较差异均有统计学意义（P <0.05）。SOD与ROS水平之间呈负相关（γ=-0.462,P=0.054）。结论:（1）2-ME在一定的浓度范围内,呈剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡。（2）2-ME通过上调促凋亡基因caspase-3和（或）下调抗凋亡基因XIAP的表达、抑制SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。第三部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞L-选择素及其基因表达的影响目的:检测2-ME对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞L-选择素及其基因表达的影响,并探讨其作用机制。方法:（1）FCM检测K562细胞L-选择素蛋白表达。（2）半定量RT-PCR检测K562细胞L-选择素基因表达。结果:（1） 2-ME对K562细胞L-选择素蛋白表达的影响:FCM定量检测不同浓度2-ME与K562细胞作用36h后L-选择素蛋白表达,结果表明,随着2-ME浓度增加,L-选择素蛋白表达量逐渐增加,2-ME浓度为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L四组L-选择素蛋白表达量与对照组比较有统计学意义（P<0.05）。（2） 2-ME对K562细胞L-选择素基因表达的影响:应用半定量RT-PCR检测与不同浓度2-ME作用36h后的K562细胞L-选择素基因表达,结果表明,随着2-ME浓度增加,L-选择素基因表达量逐渐增加,与对照组比较均有显著性差异（P<0.01）。（3） L-选择素mRNA与蛋白表达之间的关系:采用相关分析结果显示,L-选择素mRNA与蛋白表达之间呈正相关（γ=0.758,P=0.004）。（4）L-选择素蛋白与P210bcr/abl蛋白表达的关系:采用相关分析结果显示,L-选择素蛋白与P210bcr/abl蛋白表达之间呈负相关（γ=0.-976,P=0.001）。结论:2-ME能够增加K562细胞L-选择素mRNA及其蛋白表达,因而改善或恢复K562细胞的粘附缺陷。第四部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞bcr/abl融合基因表达的影响目的:检测2-ME对白血病K562细胞bcr/abl mRNA及其蛋白P210表达的影响,并探讨其作用机制。方法:（1） SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测K562细胞bcr/abl mRNA表达。（2） Western印迹法检测K562细胞bcr/abl融合蛋白P210表达。结果:（1）SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感性:应用K562cDNA标准品进行10倍系列稀释后,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增,可检测到10pg的K562细胞cDNA。同时绘制标准曲线,线性及相关性好,相关系数为0.997。（2） SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法稳定性与重复性:对105拷贝定量模板分别作6次K562cDNA bcr/abl融合基因检测,得到6个Ct值,计算Ct平均值为14.95±0.54,变异系数为3.6%。（3） 2-ME对K562细胞bcr/abl mRNA表达的影响:将各个标准品的起始拷贝数取对数作为横坐标,其所对应的Ct值作为纵坐标,即可做出相应的标准曲线。将各个样本的平均Ct值代入相应的标准曲线,就可求出bcr/abl和GAPDH的拷贝数,K562细胞bcr/abl mRNA相对表达量为bcr/abl与GAPDH绝对拷贝数之比。结果表明,随着2-ME浓度增加,bcr/abl mRNA表达量逐渐减低,但与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。（4） 2-ME对K562细胞bcr/abl融合蛋白表达的影响:随着2-ME浓度增加,Western印迹法测得的K562细胞P210蛋白表达量逐渐减低,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。（5） K562细胞P210蛋白表达与细胞凋亡率的关系:经Western印迹法测得的K562细胞P210蛋白表达量和TUNEL及FCM法测得的K562细胞凋亡率分别进行相关性分析,结果表明,K562细胞的P210蛋白表达量与TUNEL及FCM法测得的K562细胞凋亡率均呈负相关（γ₁=-0.923,P₁=0.009;γ₂=-0. 821,P₂=0.045）。结论:2-ME不影响K562细胞bcr/abl融合基因mRNA表达水平,但可降低其bcr/abl融合蛋白水平,并与K562细胞的凋亡率呈负相关,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。综上所述,CML的主要特征为细胞过度增殖、凋亡受抑及粘附、迁移功能异常。本实验研究了新型抗肿瘤化合物2-ME对bcr/abl（+）CML急变期细胞系K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及粘附功能的影响,发现其具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、改善细胞粘附功能及降低细胞bcr/abl融合蛋白表达等作用,为2-ME的临床应用提供了一定的实验依据,提示2-ME在CML具有潜在的临床应用价值。