马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。由于慢病毒给人类和动物的健康造成了严重的威胁，因此慢病毒的免疫预防，尤其是艾滋病的免疫预防成为研究的热点。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的动物模型。马传贫驴白细胞弱毒疫苗（DLA-EIAV）是将分离自辽宁省的EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强（称为驴强毒，DA-EIAV），然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。在这一过程中，EIAV L株由强毒变为弱毒，用此弱毒疫苗接种动物后不表现临床症状，但可诱导免疫保护。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制，为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，我们对马传贫驴白细胞弱毒及其亲本马强毒EIAV L株前病毒进行了全基因克隆和序列测定，比较分析了二者的前病毒基因组核苷酸序列，在此基础上构建了EIAV驴白细胞弱毒株的感染性分子克隆和三株含有EIAV强/弱毒嵌合病毒基因组的重组质粒，并对EIAV弱毒株长末端重复序列（LTR）的启动子活性进行了初步研究。 本研究以DLA-EIAV感染细胞总DNA及其亲本强毒EIAVL株感染马外周血液白细胞中DNA为模板，应用PCR方法分段扩增出DLA-EIAV和L株的前病毒，并将各段扩增产物克隆后进行测序。根据国外发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列，推导出DLA-EIAV和L株全基因组核苷酸序列，经比较分析，DLA-EIAV株前病毒基因组全长8266个碱基，EIAV L株前病毒基因组共有8235bp。DLA-EIAV株与其亲本马强毒L株和驴强毒DA-EIAV株核苷酸序列相比，同源率分别为97.0%和97.5%。DLA-EIAV株和L株相比，长末端重复序列（LTR，由U3、R、U5组成）、编码囊膜糖蛋白的基因env及ORF S2的变异率很高，U3、R、U5、env及ORF S2核苷酸序列差异率分别达13.2%、7.5%、5.1%、2.7%和3.9%，env基因及ORF S2推导的氨基酸序列差异率分别为4.4%和8.8%。EIAV L株与国外已发表的一些相关毒株相比核苷酸序列差异很大，同源性只有79%，RTase的氨基酸同源率只有86%，Gag蛋白的的同源率只有79%，说明EIAV L株与国外已报道的几个EIAV毒株的亲缘关系较远。 通过对EIAV L株与DA-EIAV、DLA-EIAV及国外相关毒株的gp90推导的氨基酸序列进行比较，发现在同一毒株系列内，N-连接糖基化位点增多与病毒毒力具有正相关性。这一现象提示我们，DLA-EIAV株gp90 N-连接糖基化位点的减少可能是弱毒产生免疫保护的原因之一。 马传贝性贫血病驴白细跑弱耳及其亲本马强霉儿株）王 柳 基因组序列比较分析以及弱霉感染性分子克巨的构建2001年6月 DLA－EIAV与L株在前病毒U3增强子区的主要差别是，DLA－EIAV含有转录因子bHLH作用一致序列E－oX，而L株U3增强子区不存在这一基序。通过对DLA－EMV和L株比较发现二者TAR的二级结构不同，DLA－EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变，形成一个尿啼陡突起。由于病毒基因的表达受细胞转录因子和反式激活蛋白Tat的调控，驴白细胞弱毒增强子区卜七Ox的引入和病毒反式激活应答区TAR结构的改变，可能使弱毒的细胞嗜性改变和在体内复制能力下降，表现为毒力减弱。 将克隆的DLA－EDeV株各个片段顺次连接，获得了一个含有EMV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为EIAV－ps．2，经核昔酸序列分析，证明ps二含有EIAV前病毒的全基因。用EMV－ps．2转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ps二衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后，第4天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明EMV－ps二具有感染性，获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆。 为了进一步研究弱毒LTh和env基因的变异与毒力减弱及诱导免疫保护之间的关系，我们将 DLA－EL＼V感染性分子克隆的乙h用 EInV L株的 LTR替换，另外将DLA－EMV感染性分子克隆的gp90编码区用乙株的gp90编码区替换，并将EIAV L株的LTh和gp90编码区同时替换DLA－EMV株感染性分子克隆的相应片段，获得了三株含有EIAV强溺毒嵌合病毒基因组的重组质粒。 将我国马传贫病毒弱毒株的长末端重复序列克隆于含CAT基因的载体中，获得重组质粒 pCAT七TR，用 pCAT－LTh分别转染驴胎皮肤细胞（FDD）、胶质母细胞瘤 （TJ－905）细胞、驴臼细胞及接种 EtaV弱毒的 FDD和驴白细胞，结果以 EIAV弱毒的LTR为启动于，CAT在这几种细胞中均获得了不同程度的表达，证实了我国EMV弱毒株的LTh在FDD、TJ－905及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能，并能被反式激活表达。 总之，本研究首次获得了我国DLA－EIAV和L株前病毒全基因克隆，确定了DLA－EIAV和 L株前病毒基因组核昔酸全序列，?