应激是激源(stressor)刺激引起的机体全身性非特异性适应反应。对激源刺激的应答主要引起下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenalaxis,HPA)及交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)的活动增强,导致儿茶酚胺、糖皮质激素及其他应激相关激素释放,尤其是长期处于应激状态(慢性应激)时,应激相关激素的持续释放可对疾病的进展及预后(特别是肿瘤)产生更为深远的影响。近年来,大量的研究结果表明,原发肿瘤分泌的肿瘤相关因子(tumor derived factor)可通过自分泌和旁分泌的方式,远距离地调变未来转移的器官(预转移器官,pre-metastatic organs),形成有利于肿瘤细胞定植和生长的微环境(预转移微环境,pre-metastatic microenvironment)。慢性应激可导致体内神经-内分泌-免疫网络紊乱,机体内环境自稳的扰动亦可能影响预转移器官微环境的重塑。然而,机体内环境的变化在肿瘤转移中的作用长期以来一直被忽视。在本研究中,我们采用慢性不可预见性应激(chronic unpredictable stress,CUS)小鼠模型,探索慢性应激及β肾上腺素能信号活化对乳腺癌肺转移的影响。主要研究结果如下:1.慢性心理应激通过激活β肾上腺素能信号促进乳腺癌肺转移我们给予Balb/C雌性小鼠CUS刺激,或采用β-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO)腹腔注射以模拟慢性心理应激反应中儿茶酚胺水平升高,连续5天,随后皮下接种4T1小鼠乳腺癌细胞,并继续每天给予CUS或ISO刺激。21天后,观察小鼠肺组织中肿瘤转移灶的形成。结果显示,CUS及ISO组小鼠肺转移灶明显多于对照组,表明CUS可促进小鼠乳腺癌自发性肺转移。应用6-OHDA化学性切割肾上腺素能神经末梢或腹腔注射β-AR广谱抑制剂普萘洛尔,均可明显逆转CUS/ISO诱导的小鼠乳腺癌自发性肺转移,提示慢性应激条件下儿茶酚胺持续释放诱导的β肾上腺素能信号活化可促进乳腺癌肺转移。2.β肾上腺素能信号激活促进循环肿瘤细胞转移性定植肿瘤细胞在转移部位的定植和增殖是转移性肿瘤形成的限速步骤。我们利用实验性肿瘤转移模型,即通过尾静脉注射小鼠乳腺癌细胞(主要引起肿瘤细胞肺转移),探索β肾上腺素能信号对乳腺癌细胞转移性肺定植的影响。我们观察到,用ISO预刺激小鼠仅3天,即可明显地促进循环乳腺癌细胞在肺部定植,6-OHDA和普萘洛尔则可有效地抑制CUS或ISO诱导的肺转移灶形成。采用自发乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的研究进一步证实,在肿瘤预转移期给予CUS或ISO刺激,可加速肺转移灶的形成。我们的研究结果提示,在慢性心理应激状态下,β肾上腺素能信号持续活化可调变预转移期小鼠肺组织微环境,促进播散的乳腺癌细胞归巢及加速肺组织中转移灶的形成。3.巨噬细胞在β肾上腺素能信号激活诱导的肺预转移微环境形成中发挥关键作用多种类型的免疫细胞参与预转移微环境的形成。为了探索预转移期肺组织中受儿茶酚胺影响的免疫细胞类型,我们利用Balb/C裸鼠(先天性胸腺缺陷的突变小鼠)、NSG小鼠(缺乏成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞)重复上述实验。结果表明,T、B、NK细胞可能不是受ISO影响在预转移期发挥关键作用的细胞。然而,当我们通过尾静脉注射巨噬细胞清除剂氯膦酸二钠脂质体,去除小鼠循环及组织中的单核/巨噬细胞后,ISO诱导的循环肿瘤细胞在肺中的定植明显减少。给予小鼠鼻腔滴入氯膦酸二钠脂质体,特异性地去除小鼠肺组织中的巨噬细胞,亦可明显逆转ISO诱导的循环肿瘤细胞在肺中转移性定植。这些结果提示,巨噬细胞是受β肾上腺素能信号诱导的主要效应细胞,巨噬细胞在肺预转移微环境形成中发挥主导作用。4.β肾上腺素能信号激活诱导巨噬细胞在肺组织中聚集为了进一步研究在慢性应激条件下,巨噬细胞在预转移肺中的作用,我们首先观察了儿茶酚胺诱导后肺组织中巨噬细胞的动态变化。结果显示,用ISO刺激小鼠5天后,即可见肺组织中CD11b+F4/80+巨噬细胞的数量明显增多,提示体内儿茶酚胺水平升高可促进巨噬细胞在肺组织中聚集。皮下接种4T1细胞亦可导致小鼠肺组织中CD11b+F4/80+巨噬细胞数量增多,表明肿瘤细胞可能通过旁分泌的方式促进肺组织中巨噬细胞浸润。然而,用ISO刺激皮下接种4T1细胞的小鼠后,肺组织中CD11b+F4/80+阳性的巨噬细胞浸润最为显著,提示儿茶酚胺和肿瘤细胞源性相关因子对荷瘤小鼠肺预转移微环境可产生叠加效应。流式细胞分析结果显示,皮下接种4T1细胞或ISO刺激均可导致小鼠外周血、脾脏及骨髓中Ly6C+CD11b+CD115+单核细胞的比例升高。然而,当荷瘤小鼠给予ISO刺激后,单核细胞的数量变化为最显著。应用抗F4/80单克隆抗体及免疫组化染色分析结果证实,与单独皮下接种4T1细胞组相比,ISO刺激皮下接种4T1细胞的小鼠肺中巨噬细胞浸润更为显著,可见F4/80+巨噬细胞聚集于肺终末支气管周围,且随时间的延长,巨噬细胞的数量可进一步增多。我们的实验证实,在肿瘤细胞到达肺组织之前,儿茶酚胺诱导的β肾上腺素能信号激活可诱导骨髓单核细胞动员及肺组织中巨噬细胞聚集。5.慢性心理应激刺激肺组织CCL2表达为了探索儿茶酚胺诱导肺组织中巨噬细胞浸润的分子机制,我们给予小鼠CUS或ISO连续刺激5天后,通过ELISA法检测肺组织裂解物中单核/巨噬细胞趋化因子CCL-2的表达。结果显示,CUS或ISO预刺激可导致肺组织中CCL2的表达水平明显升高,普萘洛尔可明显逆转CUS诱导的CCL2表达上调,提示慢性应激通过激活β肾上腺素能信号促进肺组织中CCL2的表达。进一步的实验证实,ISO刺激或皮下接种肿瘤细胞均能明显地增强肺组织中CCL2的表达,而ISO刺激荷瘤小鼠则可进一步上调肺组织中CCL2的水平,提示预转移期儿茶酚胺水平升高是影响预转移肺微环境的重要因素。体外实验研究发现,ISO能明显刺激原代肺微血管内皮细胞中CCL2的表达,β-AR/PKA通路抑制剂普萘洛尔及H89可有效地抑制ISO诱导的CCL2表达上调。ELISA分析结果显示,CUS刺激的荷瘤小鼠肺组织中NE水平明显升高,且与肺组织中CCL2表达上调相对应。这些结果提示,慢性应激条件下儿茶酚胺持续释放可通过激活β-AR/PKA通路,诱导小鼠肺微血管内皮细胞中CCL2表达,从而吸引循环单核细胞进入肺组织。6.ISO诱导单核/巨噬细胞表达CCR2CCR2是CCL2的受体。趋化因子与趋化因子受体结合,可通过激活多种信号通路,介导细胞的迁移、生长及活化。为了探索在儿茶酚胺诱导下巨噬细胞表面趋化因子受体的表达是否发生改变以及趋化因子受体表达水平升高是否与肺组织中巨噬细胞聚集有关,我们观察了外周血中单核细胞表面CCR2表达的变化。结果显示,肿瘤预转移期间ISO刺激可导致小鼠外周血单核细胞中CCR2表达明显升高。给予小鼠腹腔注射CCL2中和性抗体,则可明显地抑制CUS或ISO诱导的巨噬细胞在肺组织中的浸润。我们又以人单核细胞系THP-1及小鼠单核细胞系Raw264.7为细胞模型,证实ISO刺激确实能明显促进人单核细胞及小鼠单核细胞中CCR2表达上调,H89或普萘洛尔均能明显逆转ISO的效应,表明ISO通过激活β-AR/PKA信号通路,促进单核/巨噬细胞表达CCR2。腹腔注射普萘洛尔可减少小鼠肺组织中转移灶的数量达~90%,提示在预转移期阻断β肾上腺素能信号通路激活有可能控制肿瘤转移的重要限速步骤。综上所述,我们的研究结果证实,慢性心理应激诱导的β肾上腺素能信号可促进骨髓中单核细胞动员、迁出及进入外周血循环。同时,通过激活CCL2/CCR2轴,上调单核/巨噬细胞中CCR2的表达及肺微血管内皮细胞中CCL2的表达,诱导巨噬细胞向肺组织趋化、浸润,调变预转移肺组织微环境,从而促进循环肿瘤细胞在肺组织中的浸润及定植。