论文部分内容阅读
树突状细胞(dendritic cells，DCs)被确认为是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，是机体的哨位系统，具有启动T细胞介导的免疫反应的功能，是体内唯一能激活nalve T细胞的专职抗原提呈细胞”。与机体的免疫状态密切相关，它能摄取各类抗原，在机体细胞免疫和体液免疫调控中均起着重要作用，且在肿瘤免疫治疗中已显示出其独特的临床应用价值。
研究表明，肿瘤诱导的DC功能异常是肿瘤逃逸的主要机制之一，主要表现为功能完善的成熟DC(mature DC，mDC)的减少以及不成熟DC(immatureDC，iDC)在肿瘤局部的聚集，引起机体对肿瘤抗原的免疫耐受并促进肿瘤生长。
激发DC细胞功能，采用DC细胞为基础的肿瘤免疫治疗及肿瘤基因治疗已经是目前医学界研究的热门课题。20世纪90年代以来，人们在体外诱导扩增DC成功之后，克服了以往由于DC在组织中含量很少、难以获取的困难，使DC研究取得了许多突破性的进展。DC的发现和研究进展为中药复方抗肿瘤免疫药理研究提供了新的视角，即中药复方抗肿瘤的免疫药理学机制是否部分与影响肿瘤机体DC细胞增殖、成熟和表型及功能的改变有关
近年来采用扶正增免方治疗化疗后的恶性血液病患者，临床证明有减少感染，维持缓解，延缓复发，具有清除体内微小残留病灶，促进长期生存，提高生存质量等作用。因此，我们希望通过进一步的体外实验观察其是否能增强对外周血树突状细胞的诱导并使其活性增强，从一个新的角度阐明其抗肿瘤的机理。
本实验参照Romani等分离培养DCs的方法，以无血清RPMI1640悬浮沉淀细胞，调整细胞密度为5×104/ml，接种于六孔培养板(每孔4ml RPMI1640)，置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中温育2小时，轻轻吸出非贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，分为实验组与对照组，对照组加入GM-CSF及IL-4分别至终浓度1000U/ml和500U/ml，实验组在此基础上加扶正增免方制剂(设5个浓度组：50ul/4ml、25ul/4ml、12.5ul/4ml、6.25ul/4ml、3.125ul/4ml)，于37℃，5％CO2条件下培养，每3天补充半量新鲜培养液及相应的细胞因子，第5天加用TNF-α100U/ml。
在细胞培养过程中用倒置显微镜动态观察细胞，必要时计数，并予摄像记录。采用流式细胞术直接免疫荧光标记法，在DCs培养的第7天收集细胞调整细胞密度为1×106/ml，每管取悬液100ul，分别加入FITc-标记的CD1a、HLA-DR及PE标记的CD86单抗各10ul直接染色，充分混匀后置室温下暗室反应15min。加PBS液，1000r/min，离心5min，洗涤后，以1％多聚甲醛固定备作流式细胞仪检测，用Cell Quest软件计算阳性细胞比率。并取培养第7天的DCs行混合淋巴细胞反应，通过MTT法比较各组的吸光度。
结果显示：在体外培养DCs时加入扶正增免方制剂(<25ul/4ml浓度时)对DCs的形态均无显著影响；25ul/4ml、12.5ul/4ml，6.25ul/4ml、3.125ul/4ml的扶正增免方制剂干预的实验组中细胞计数均比对照组高，且差异具有显著性(P<0.05)。而50ul/4ml的中药组中的细胞计数明显减少。对照组及实验组在细胞形态方面，除50ul/4ml浓度时镜下观察到从d4开始细胞减少，后期部分死亡，其余未见显著差异。在对于各组DC免疫表型的检测中，我们发现在扶正增免方制剂25ul/4ml浓度内，对CD1a、CD86的表达，有扶正增免方制剂干预的实验组均高于等于对照组，且差异均有显著性(P<0.05)，HLA-DR的表达两组无显著差异，几乎均完全表达。但当中药浓度提高至50ul/4ml时，对CD1a、CD86、HLA-DR的表达却表现出下降的趋势。比较CD1a、CD86的流式检测结果，我们发现25ul/4ml浓度内，随着扶正增免方制剂浓度的增加，DCs表面特异性标志的表达无显著性差异(P>0.05)，而至50ul/4ml浓度时，这些表面特异性标志的表达反而是较前降低的，差异具有显著性(P<0.05)。因此，从细胞数量以及流式细胞仪检测DCs表面特异性标志表达中，可以认为扶正增免方制剂在25ul/4ml浓度内在本实验中可促进DCs的生长和成熟。
在混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaetion，MLR)实验中，扶正增免方制剂干预的DCs的吸光度(OD值)均高于未经扶正增免方制剂干预的对照组，差异有显著性(P<0.05)，并随扶正增免方制剂剂量递增，OD值也呈递增趋势。其中12.5ul/4ml组扶正增免方制剂干预组的OD值就高于6.25ul/4ml组。其中又以刺激细胞(DCs)与反应细胞(T细胞)比值为1:100时对扶正增免方制剂的干预最为敏感。
本研究动态观察了在外周血来源的DCs的体外培养中加入或不加扶正增免方制剂，DCs的形态与数量变化，以及在DCs成熟后其免疫活性的不同。通过上述实验我们可以发现扶正增免方制剂不仅可以通过传统的口服给药来调节机体的免疫功能，而且，在体外诱导培养DCs时用扶正增免方制剂进行干预还可以促进DCs的生长、成熟及对T细胞的增殖反应.因而为复方中药抗肿瘤免疫药理的研究提供一个新的视角，也对今后深入研究复方中药抗肿瘤的免疫学机制以及复方中药在肿瘤免疫治疗方面的应用提供了科学的理论依据。