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牛病毒性腹泻-黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛的一种热性传染病,呈世界性分布,常造成牛只持续性感染和免疫抑制,以腹泻,消化道黏膜发炎、糜烂和坏死,并发呼吸道感染为主要临床特征,该病严重影响动物的生产性能,给养牛业造成了重大经济损失。因此,深入研究BVDV的致病机制对该病的防治具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)广泛参与调控多种疾病的发生发展,如lnc RNA在病毒感染性疾病中参与病毒与宿主之间的互作,经多种方式调控病毒感染的致病过程,同时亦能够调节宿主免疫以抑制病毒的感染。已有研究表明,在BVDV感染的致病过程中,BVDV可诱导细胞凋亡,为进一步认知BVDV诱导细胞凋亡的分子机制,本研究采用RNA-seq技术分析了BVDV感染宿主(MDBK)细胞后的lnc RNA差异表达谱,通过KEGG信号通路富集分析及lnc RNA-m RNA共表达网络分析,筛选出具有调控细胞凋亡的lnc RNAs,并对其潜在的调控机制进行了研究。本研究采用RNA-seq技术测序分析,获得了BVDV感染MDBK后的lnc RNA差异表达谱。具体内容如下:分别提取经BVDV AV69病毒株感染48 h后的MDBK细胞总RNA(实验组)以及未感染病毒的MDBK细胞总RNA(对照组),将符合条件的RNA样本(每组3个平行样本,且RNA样本完整性>9.8、吸光度260/280>2、总量>2μg)进行建库以及转录组测序分析;将合格的测序数据利用软件Top Hat 2.1.1与牛的参考基因组进行比对,然后利用Cufflinks进行转录本组装以及CNCI、CPC、PCA进行lnc RNAs预测,再利用RSEM软件以及FPKM计算实验组的lnc RNAs和m RNAs相对于对照组的表达量。结果显示,共获得1591个差异倍数>1且p-value<0.05的m RNAs,包括895个表达上调的m RNAs和696个表达下调的m RNAs;获得差异表达的lnc RNAs共计156个,其中表达上调的lnc RNAs 72个,表达下调的lnc RNAs 84个;采用RT-q PCR方法对随机选取的差异性表达的m RNAs(BIRC2、IGF1R、PTCD2、DTX2、MAPK8和GTF2I)水平以及差异性表达的lnc RNAs(loc101906383、TCONS00026615、loc112444864、loc101905498、loc104969159和loc104974530)水平进行了符合验证,结果显示,RT-q PCR检测结果与RNA-seq测序结果基本一致,表明RNA-seq测序结果可信;将差异表达的m RNAs进行GO和KEGG通路富集分析,结果显示,差异表达的m RNAs显著富集于TNF、NLRs、NF-κB、细胞凋亡、Hippo、TLRs等信号通路;将差异表达的lnc RNAs和m RNAs进行lnc RNAs-m RNAs共表达网络分析,共得到5个lnc RNA-m RNA共表达网络;进一步分析发现lnc RNA loc104974530与细胞凋亡调控关键因子MAPK8之间潜在正调控关系。本研究对lnc RNA loc104974530调控MAPK8转录对细胞凋亡的影响及其机制进行了探索。研究表明,BVDV感染MDBK后宿主lnc RNA loc104974530的表达水平显著下调,随之MAPK8的m RNA转录水平及蛋白表达水平也显著下调,同时凋亡相关基因Caspase-3和抗凋亡基因Bcl-2的转录水平及蛋白表达水平显著上升,表明BVDV感染促进了细胞凋亡的发生,并且感染的细胞出现早期凋亡峰(流式分析)。RNAscope分析结果显示,lnc RNA loc104974530主要位于细胞核内,MAPK8位于细胞质中,当BVDV感染MDBK细胞后,胞质中的MAPK8被lnc RNA loc104974530招募入核。此外,lnc RNA loc104974530在BVDV感染早期对病毒复制有调控作用,过表达lnc RNA loc104974530在病毒感染24-48h内病毒的复制能力增强,同时MAPK8的m RNA转录水平及蛋白表达水平也随之上升,导致凋亡相关基因的m RNA转录水平及蛋白表达水平下降,进一步证实lnc RNA loc104974530与MAPK8之间存在正调控关系。同时,流式细胞术检测结果显示,过表达lnc RNA loc104974530后,细胞凋亡率降低,Caspase-3活性降低,表明过表达lnc RNA loc104974530可抑制BVDV诱导的细胞凋亡,调控Bcl-2和Caspase-3的表达。综上,本研究利用RNA-seq技术测序分析获得了BVDV感染宿主细胞MDBK后的lnc RNA差异表达谱,通过lnc RNAs-m RNAs共表达网络分析,筛选出了与细胞凋亡关键因子MAPK8潜在调控关系的lnc RNA loc104974530,并对lnc RNA loc104974530调控MAPK8转录对细胞凋亡的影响及其机制进行了研究,结果显示,宿主细胞感染BVDV前期,可通过下调lnc RNA loc104974530表达水平而抑制MAPK8的m RNA转录及蛋白表达,进而间接促进Bcl-2和Caspase-3的转录与表达,引起细胞发生自主性凋亡,以抑制病毒的复制;在病毒感染后期,BVDV诱导lnc RNA loc104974530表达水平上调,进而诱导细胞发生被动凋亡,以促进病毒粒子的释放。本研究结果为进一步认知在BVDV感染的致病过程中,BVDV与宿主细胞的互作机制提供了理论基础。