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背景:神经胶质瘤是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率每年持续增长。目前针对神经胶质瘤的治疗手段主要有手术切除、化学治疗、放射治疗等。然而,神经胶质瘤具有高度侵袭的特征,使得其与周围正常组织的边界模糊不清;脑部神经丰富,手术禁区多;以及血脑屏障、血-肿瘤屏障等阻碍治疗药物递送的干扰因素的存在,这些都使得神经胶质瘤的治疗难度大,疗效不佳,患者预后差,肿瘤易复发,中位生存期短,这说明了治疗神经胶质瘤仍是一个巨大的挑战。因此,探索与开发出高效、低毒的治疗神经胶质瘤的新方法刻不容缓。天然黄酮类化合物因其有效的抗肿瘤活性、生物毒性低等优异特性,目前作为抗肿瘤药物被广泛研究。香叶木素属于天然黄酮类化合物,已有研究表明,它能够促进胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用,因此香叶木素被认为在胶质瘤的治疗上具有极大的潜在应用前景。但是目前关于香叶木素治疗胶质瘤及其机制研究的报道甚少。PI3K/AKT/m TOR信号通路是细胞内经典的信号转导途径之一,广泛存在各种细胞中,参与细胞内多种生理病理活动,在抑制细胞凋亡,促进细胞增殖、分化、迁移等方面起着至关重要的作用,并与胶质瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。本课题将利用体外细胞实验证明香叶木素是否通过影响PI3K/AKT/m TOR信号通路发挥抗胶质瘤作用,以探讨它的潜在作用机制。目的:我们从胶质瘤细胞C6细胞、U118细胞、TG98细胞中筛选出对香叶木素最敏感的胶质瘤细胞株,并从PI3K/AKT/m TOR信号通路这一角度考虑,以初步探究香叶木素抗胶质瘤作用是否与它干扰胶质瘤细胞内PI3K/AKT/m TOR信号通路相关,从而为香叶木素应用于胶质瘤的治疗提供一定的理论依据。方法:(1)采用CCK-8法检测香叶木素对胶质瘤细胞C6细胞、U118细胞、TG98以及正常的小鼠脑星形细胞C8-D1A细胞活力的影响,并从这3株胶质瘤细胞中筛选出敏感性最强的一株细胞以初步探讨香叶木素抑制胶质瘤的作用机制。(2)采用Calcein AM染色进一步验证香叶木素抑制C6细胞增殖。(3)采用荧光探针DCFH-DA检测香叶木素对C6细胞内ROS的影响。(4)采用Hoechst 33342/PI双染、倒置显微镜检测香叶木素对C6细胞凋亡及形态的影响。(5)采用流式细胞仪(PI/RNase染色)检测香叶木素对C6细胞周期的影响。(6)采用细胞划痕实验、Transwell迁移实验检测香叶木素对C6细胞迁移能力的影响。(7)采用细胞免疫组化法、Western blot法检测香叶木素对C6细胞内PI3K/AKT m TOR信号通路分子p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达量及PI3K、AKT、m TOR的磷酸化水平的影响。结果:(1)CCK-8法、Calcein AM染色检测结果显示:与空白对照组相比,浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素对C6细胞、U118细胞、TG98细胞这3株胶质瘤细胞均有一定的抑制作用,且呈一定的浓度与时间依赖性,其中C6细胞对香叶木素最敏感;香叶木素对小鼠脑星形细胞C8-D1A无明显抑制作用。(2)荧光探针DCFH-DA检测结果显示:浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素分别作用C6细胞24 h、48 h、72 h,与空白对照组相比,香叶木素能够明显降低细胞内ROS水平降低,且随着香叶木素作用时间的延长或作用浓度的增大,细胞内ROS含量越少。(3)Hoechst 33342/PI双染、倒置显微镜检测结果显示:浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素处理C6细胞后,与空白对照组相比,可见细胞数量减少、间隙变大、体积变小、碎片增多,细胞凋亡率上升。(4)细胞周期检测结果显示:浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素分别作用C6细胞12 h,与空白对照组相比,香叶木素能够诱导C6细胞周期停滞在G0/G1期,且与浓度成一定的正相关。(5)细胞划痕实验及Transwell迁移实验检测结果显示:浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素分别作用C6细胞后,与空白对照组相比,香叶木素浓度越大,其抑制C6细胞迁移的能力越强。(6)细胞免疫组化法、Western blot法检测结果显示:浓度为12.5μM、50μM、200μM香叶木素作用C6细胞24 h,与空白对照组相比,细胞内p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白表达水平均降低,且PI3K、AKT、m TOR的磷酸化水平下降。结论:(1)通过检测香叶木素对胶质瘤细胞以及正常小鼠脑星形细胞的活力的影响,表明了香叶木素具有高效低毒的特性。(2)香叶木素可能通过抑制C6细胞内PI3K/AKT/m TOR信号通路的活性,从而发挥抑制C6细胞生长增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期停留在G0/G1期、抑制细胞迁移的作用,这为香叶木素治疗胶质瘤的研究提供了一定的思路、方法以及理论依据。