第一部分Id-1基因在口腔癌细胞中的表达目的口腔癌是临床较常见疾病,近年来发病率有增加趋势,其发病年龄以40～60岁为发病高峰年龄段,但60～70岁年龄段发病率明显增加,占总数17.8%,发病平均年龄54.1岁,表明口腔癌发病有老龄化趋向。口腔癌大部分发生于口腔(唇部除外),占总数78.4%,其他依次为大唾液腺、上颌窦、颈、咽、唇部。口腔中好发部位按序为舌、上下牙龈、颊、腭、上下颌骨、口底,舌癌已跃居首位。口腔癌的病理类型以鳞癌和腺样囊性癌居多,这两种类型恶性程度也比较大,容易复发和转移,尤其是腺样囊性癌,极容易发生远处转移,而且具有嗜神经性。因此,我们选择了最具代表性的鳞癌细胞系SAS、Tca8113、Bucc1885和腺样囊性癌的细胞系ACCM、ACC-2这五种典型的口腔癌细胞系进行筛选。DNA结合抑制蛋白(Inhibitor of DNA binding，Id),属于螺旋-环-螺旋蛋白质超家族,相对分子质量为13000～20000,它是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。Id-1是人类迄今为止发现的4个Id蛋白家族成员(Id-1-4)中研究最多,也是最重要的一个。研究发现：Id-1在上皮来源的肿瘤中呈高表达,它通过抑制细胞分化、推进细胞周期进程、诱导细胞增殖、抑制衰老、诱导侵袭、参与肿瘤性血管新生而介导肿瘤的发生和发展；在大肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展过程中都发挥着重要的作用。然而在口腔癌中,Id-1的表达量如何,其对于口腔癌细胞的生长和侵袭能力的影响尚不得而知。本研究将检测口腔癌这五种典型细胞系的Id-1表达情况。方法口腔鳞癌细胞系SAS、Tca8113、Bucc1885和腺样囊性癌的细胞系ACCM、ACC-2解冻复苏,于含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、含5%CO2的细胞培养箱中密闭培养。取对数生长的细胞,用Trizol裂解液提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA，然后用Id-1引物进行(Real-time fluorescence quantitative PCR, RFQ-PCR)扩增,扩增体中加入SYBR Green I,进行RFQ-PCR实验,检测五种细胞系的Id-1基因的1mRNA表达情况。再取对数生长的细胞,常规方法提取细胞总蛋白,一抗和二抗孵育,进行Western Blot实验,检测五种细胞系的Id-1基因的蛋白表达情况。结果实验结果显示,鳞癌细胞系SAS、Tca8113、Bucc1885和腺样囊性癌的细胞系ACCM、ACC-2五种细胞系Id-1均呈现高表达,其中,腺癌细胞系Id-1表达量最高的是ACCM,鳞癌细胞系Id-1表达量最高的是SAS。RFQ-PCR结果显示：腺癌细胞系Id-1mRNA表达量最高的是ACCM(P<0.05),鳞癌细胞系Id-1mRNA表达量最高的是SAS(P<0.05)c Western Blot结果显示：其中,腺癌细胞系Id-1表达量最高的是ACCM(P<0.05),鳞癌细胞系Id-1表达量最高的是SAS(P<0.05)。结论实验结果提示,鳞癌细胞系SAS、Tca8113、Bucc1885和腺样囊性癌的细胞系ACCM、ACC-2五种细胞系Id-1mRNA和Id-1蛋白均呈现高表达,其中,腺癌细胞系Id-1表达量最高的是ACCM,鳞癌细胞系Id-1表达量最高的是SAS。我们筛选出了腺癌细胞系Id-1表达量最高的ACCM和鳞癌细胞系Id-1表达量最高的SAS两个细胞系。第二部分沉默Id-1基因对腺样囊性癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响目的腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC),是发生于头颈部涎腺最常见的恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤20%,具有高度的侵袭和转移特性。由于对ACC生物学性质认识上的局限性,目前尚无很有效的治疗措施,即使进行了广泛的手术切除及放射治疗,大多数患者最终出现复发和转移。临床上急待寻求治疗ACC的新方法。Id蛋白属于螺旋-环-螺旋蛋白质超家族,相对分子质量为13000～20000,它是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。bHLH蛋白二聚体的形成是DNA与“E盒”(CANNTG)或“N盒”(CACNAG)识别序列结合的必要条件,Id蛋白通过与bHLH转录因子形成异型二聚体,干扰其与DNA的结合,阻断其对下游分子的转录激活作用,抑制基因的表达,从而抑制细胞的正常分化,促进细胞增殖。Id-1是人类迄今为止发现的4个Id蛋白家族成员(Id-1-4)中研究最多,也是最重要的一个。研究发现：Id-1在上皮来源的肿瘤中呈高表达,它通过抑制细胞分化、推进细胞周期进程、诱导细胞增殖、抑制衰老、诱导侵袭、参与肿瘤性血管新生而介导肿瘤的发生和发展；在大肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展过程中都发挥着重要的作用。然而在ACC中,Id-1的表达量如何,其对于ACC的生长和侵袭能力的影响尚有待于研究证实。以往研究发现的与肿瘤相关的Id-1信号通路有很多,有Akt-mediated Wnt信号通路,p53 and NF-kB信号通,PI3K/Akt/NFkB信号通路,ERK/MAPK信号通路等等。我们前期研究发现,正常涎腺组织中Id-1的表达量非常低(甚至难以检测到),但是在涎腺腺样囊性癌中却呈现高表达,这说明Id-1表达水平的升高可能打破了正常细胞内癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系,进而激活某条或多条信号传导通路推进细胞周期进程、抑制细胞分化、促进细胞增殖,从而诱导正常细胞向肿瘤细胞转化,增加通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。我们选用设计好的Id-1siRNA序列,应用lipofectamine2000进行转染,沉默掉ACCM细胞系的Id-1基因,然后检测ACCM细胞系增殖、侵袭和凋亡的改变及ki67、c-myc和p21蛋白含量变化。方法于含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、含5%C02的细胞培养箱中密闭培养腺样囊性癌高转移细胞系ACCM。用设计好的Id-1siRNA序列,应用lipofectamine 2000进行转染,沉默ACCM细胞系的Id-1基因。RFQ-PCR、Westernblot检测、免疫荧光确认干扰成功。MTT比色法于570 nm处测定光密度值(OD),描记干扰前后细胞的生长曲线。Transwell小室检测干扰前后细胞侵袭性能的改变。流式细胞仪检测干扰前后细胞的凋亡情况。Western blot检测ki67、c-myc和p21蛋白含量变化。结果实验结果显示RFQ-PCR、Western blot检测、免疫荧光确认干扰成功。MTT比色法描记的干扰前后细胞的生长曲线结果显示：Id-1siRNA干扰后ACCM增殖能力下降,与未干扰对照组有显著差异(0.5806±0.0063vs0.7469±0.0424,P<0.01；0.6378±0.0040vsl.0110±0.0010，P<0.01；0.7679±0.0036vs1.2774±0.0036,P<0.01)。Transwell小室检测的结果显示：Id-1siRNA干扰后ACCM侵袭能力下降,与未干扰对照组有显著差异((10.6667±2.0656)vs(29.8333±1.7224),P<0.01)。流式细胞仪检测的凋亡结果显示：Id-lsiRNA干扰后ACCM凋亡增多,与未干扰对照组有显著差异((23.2767±1.2872)%vs(2.2467±0.0924)%,P<0.01)。Western blot检测ki67、c-myc和p21蛋白含量变化显不：Id-1siRNA干扰后ACCM中ki67含量减少、c-myc含量减少和p21含量增加,与未干扰对照组有显著差异。结论结果提示通过RNA干扰沉默Id-1基因后,ACCM生长受到抑制、侵袭能力均受到抑制,细胞凋亡增多；ACCM中ki67含量减少、c-myc含量减少和p21含量增加。其机制可能是通过沉默Id-1基因,腺样囊性癌细胞系ACCM本来呈现高表达的Id-1出现低表达或者无表达,本来被打破了的癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系恢复了正常,激活了的某(些)条信号传导通路得到抑制或者关闭,抑制细胞周期进程、促进细胞分化、抑制细胞增殖,抑制了通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。但是Id-1对ACC生长和侵袭起调节作用的精确信号传导通路,还有待进一步的研究与探讨。第三部分沉默Id-1基因对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响目的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔癌90%以上2005年WHO头颈肿瘤病理学和遗传学分类中将口腔鳞状细胞癌定义为“一种具有不同程度分化的侵袭性肿瘤,倾向于早期、广泛的淋巴结转移,主要发生于40-70岁的烟酒嗜好者。口腔癌是恶性程度较高的肿瘤,虽然经肿瘤学家、外科医师的不断努力,在过去20年里口腔癌的死亡率略有下降,但其5年生存率仍只有41%-79.5%,这促使人们努力寻找与肿瘤预后相关的因素,以采取更有针对性的措施进行预防和治疗。Id蛋白属于螺旋-环-螺旋蛋白质超家族,相对分子质量为13000～20000,它是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。bHLH蛋白二聚体的形成是DNA与“E盒”(CANNTG)或“N盒”(CACNAG)识别序列结合的必要条件,Id蛋白通过与bHLH转录因子形成异型二聚体,干扰其与DNA的结合,阻断其对下游分子的转录激活作用,抑制基因的表达,从而抑制细胞的正常分化,促进细胞增殖。Id-1是人类迄今为止发现的4个Id蛋白家族成员(Id-1-4)中研究最多,也是最重要的一个。研究发现：Id-1在上皮来源的肿瘤中呈高表达,它通过抑制细胞分化、推进细胞周期进程、诱导细胞增殖、抑制衰老、诱导侵袭、参与肿瘤性血管新生而介导肿瘤的发生和发展；在大肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展过程中都发挥着重要的作用。然而在OSCC中,Id-1的表达量如何,其对于OSCC的生长和侵袭能力的影响尚有待于研究证实。以往研究发现的与肿瘤相关的Id-1信号通路有很多,有Akt-mediated Wnt信号通路,p53 and NF-kB信号通,PI3K/Akt/NFKB信号通路, ERK/MAPK信号通路等等。我们前期研究发现,正常涎腺组织中Id-1的表达量非常低(甚至难以检测到),但是在涎腺腺样囊性癌中却呈现高表达,这说明Id-1表达水平的升高可能打破了正常细胞内癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系,进而激活某条或多条信号传导通路推进细胞周期进程、抑制细胞分化、促进细胞增殖,从而诱导正常细胞向肿瘤细胞转化,增加通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。我们选用设计好的Id-1siRNA序列,应用lipofectamine 2000进行转染,沉默掉OSCC细胞系SAS的Id-1基因,然后检测SAS细胞系增殖、侵袭和凋亡的改变。方法于含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、含5%CO2的细胞培养箱中密闭培养口腔鳞状细胞癌细胞系SAS。用设计好的Id-1siRNA序列,应用lipofectamine2000进行转染,沉默SAS细胞系的Id-1基因。RFQ-PCR、Western blot检测、免疫荧光确认干扰成功。MTT比色法于570 nm处测定光密度值(OD),描记干扰前后细胞的生长曲线。Transwell小室检测干扰前后细胞侵袭性能的改变。流式细胞仪检测干扰前后细胞的凋亡情况。结果实验结果显示RFQ-PCR、Western blot检测、免疫荧光确认干扰成功。MTT比色法描记的干扰前后细胞的生长曲线结果显示：Id-1siRNA干扰后SAS增殖能力下降,与未干扰对照组有显著差异(0.68055±0.0457vs0.8469±0.0878,P<0.01；0.73775±0.0866vsl.11098±0.0899,P<0.01；0.8679±0.0442vsl.37743±0.0471.P<0.01)。Transwell小室检测的结果显示：Id-1siRNA干扰后SAS侵袭能力下降,与未干扰对照组有显著差异(10.1666667±0.012vsl7.8±0.008,P<0.01)。流式细胞仪检测的凋亡结果显示：Id-1 siRNA干扰后SAS凋亡增多,与未干扰对照组有显著差异((5.15±3.02)%vs(20.77±2.56)%,P<0.01)。结论结果提示通过RNA干扰沉默Id-1基因后,SAS生长受到抑制、侵袭能力均受到抑制,细胞凋亡增多。其机制可能是通过沉默Id-1基因,鳞状细胞癌细胞系SAS本来呈现高表达的Id-1出现低表达或者无表达,本来被打破了的癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系恢复了正常,激活了的某(些)条信号传导通路得到抑制或者关闭,抑制细胞周期进程、促进细胞分化、抑制细胞增殖,抑制了通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。但是Id-1对OSCC生长和侵袭起调节作用的精确信号传导通路,还有待进一步的研究与探讨。