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目的1.探讨环境应答基因Sox30基因调控小鼠睾丸间质细胞增殖的作用及机制。2.探讨环境应答基因Sox30基因调控小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌功能的作用及机制。方法1.利用基因重组法构建Sox30基因敲除小鼠,PCR法鉴定Sox30基因野生型(Sox30+/+)、杂合型(Sox30-/+)及纯合缺失型(Sox30-/-)小鼠基因型。称重各脏器质量,计算脏器指数。利用HE染色观察小鼠睾丸组织病理形态。采用ELISA法检测各组小鼠睾丸组织匀浆睾酮水平。2.采用慢病毒感染及si RNA干扰技术构建Sox30基因过表达及敲低TM3细胞模型,并在此细胞模型基础上分别采用CCK-8法、Ed U染色、流式细胞术检测细胞存活率、细胞周期分布,分析Sox30基因过表达及敲低对TM3细胞增殖的影响;采用ELISA法检测Sox30基因过表达及敲低TM3细胞的睾酮水平,分析Sox30差异表达对TM3细胞睾酮分泌功能的影响。3.在Sox30差异表达细胞模型基础上,采用RT-q PCR法以及Western blot法检测Sox30基因过表达及敲低后TM3细胞中细胞周期及睾酮生成相关分子的m RNA及蛋白表达水平,初步探索Sox30调控TM3细胞增殖及睾酮合成作用的分子机制。4.利用构建的Sox30基因敲除小鼠,采用RT-q PCR法及免疫组化检测不同基因型小鼠睾丸组织中细胞周期及睾酮合成相关分子的表达水平,进一步确定Sox30调控睾丸间质细胞增殖及睾酮合成作用的重要靶分子。5.采用JASPAR数据库预测Sox30与细胞周期以及睾酮合成相关分子的启动子区结合位点,初步探讨Sox30调控睾丸间质细胞周期及睾酮合成关键分子表达的机制。结果1.Sox30+/+（野生型）、Sox30-/+（杂合型）和Sox30-/-（纯合缺失型）小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、精囊腺的脏器指数均无明显差异（P>0.05）。Sox30+/+（野生型）和Sox30-/+（杂合型）组小鼠睾丸脏器指数无明显差异（P>0.05）。与Sox30+/+（野生型）和Sox30-/+（杂合型）组相比,Sox30-/-（纯合缺失型）小鼠睾丸明显变小,睾丸组织脏器指数明显降低（P<0.05）。通过HE染色进行病理形态学观察发现,与Sox30+/+和Sox30-/+组小鼠相比,Sox30-/-小鼠睾丸组织曲细精管之间的间质细胞显著增生。进一步通过ELISA法检测发现Sox30-/-组小鼠睾酮水平与Sox30+/+和Sox30-/+组小鼠比较显著降低（P<0.01）。这些结果提示Sox30可能参与睾丸间质细胞增殖及睾酮分泌功能的调控。2.利用构建的Sox30差异表达细胞模型,我们发现Sox30基因过表达TM3细胞与对照组比较存活率显著降低（P<0.05）,G1期周期阻滞明显（P<0.05）。干扰TM3细胞中Sox30的表达可导致TM3细胞存活率增加（P<0.05）,G1期细胞周期阻滞恢复（P<0.05）。同时,我们发现Sox30基因过表达可以导致TM3细胞睾酮水平升高（P<0.05）,而干扰Sox30表达后可抑制TM3细胞的睾酮含量（P<0.01）,与体内Sox30敲除小鼠结果一致。3.为了初步探讨Sox30基因参与睾丸间质细胞增殖及睾酮分泌调控的分子机制,我们进一步对Sox30差异表达细胞中细胞周期及睾酮合成相关基因和蛋白的表达水平进行检测发现:（1）Sox30基因过表达可导致TM3细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6等m RNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,而在Sox30干扰细胞模型中,抑制Sox30的表达可导致TM3细胞细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6等m RNA和蛋白表达水平显著恢复（P<0.05）。这些结果提示Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6可能是Sox30调控TM3细胞周期进程的重要靶基因。（2）Sox30基因过表达可导致TM3细胞中Hsd3b1和Hsd3b2表达水平显著降低、Cyp17a1和Hsd11b2的表达水平显著增高（P<0.05）。而干扰Sox30表达后可导致TM3细胞中Hsd3b1和Hsd3b2表达水平显著增加、Cyp17a1和Hsd11b2的表达水平显著降低（P<0.05）,提示Sox30可能通过调控Hsd3b1、Hsd3b2、Cyp17a1和Hsd11b2的表达影响TM3细胞睾酮分泌功能。4.为了进一步明确Sox30调控睾丸间质细胞睾酮分泌的靶分子,我们对Sox30+/+（野生型）、Sox30-/+（杂合型）和Sox30-/-（纯合缺失型）小鼠睾丸组织中周期调控关键分子及睾酮生成调控关键分子的表达进行体内验证。结果发现:Sox30-/-（纯合缺失型）小鼠睾丸组织中Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6等基因的m RNA相对表达水平较Sox30+/+（野生型）和Sox30-/+（杂合型）显著增加（P<0.01）,与体外细胞实验结果一致。另一方面,敲除小鼠睾丸组织中Hsd3b1和Hsd3b2的m RNA相对表达水平增加（P<0.05）,但Hsd11b2 m RNA相对表达水平降低（P<0.01）。免疫组化分析证实发现体内敲除Sox30基因,可以使敲除小鼠睾丸组织中Hsd3b的表达水平增加（P<0.05）,Cyp17a1、Hsd11b2表达水平降低（P<0.01）,与体外实验结果一致。5.在以上体内外实验研究基础上,为了进一步分析Sox30调控睾丸间质细胞周期以及睾酮合成相关基因表达的作用机制,我们通过JASPAR数据库对Sox30与细胞周期以及睾酮合成相关分子的启动子区结合位点进行预测,结果发现Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6、Hsd3b1、Hsd3b2、Cyp17a1、Hsd11b2的启动子区域均存在Sox30蛋白质可能的结合位点,提示相关基因可能受Sox30蛋白转录调控。结论1.Sox30基因敲除可以导致小鼠睾丸间质细胞异常增殖及睾丸组织匀浆中睾酮水平下降,提示Sox30基因在小鼠睾丸间质细胞调控中具有重要作用。2.Sox30基因主要通过调控细胞周期G1期影响睾丸间质细胞增殖,Cyclin D1、Cyclin D2、Cdk2、Cdk6可能是Sox30参与周期调控的下游分子。3.Sox30基因可影响小鼠睾丸间质细胞睾酮合成水平,且Sox30基因主要通过调控Cyp17a1和Hsd11b2的表达影响睾丸间质细胞的睾酮合成。