红曲菌(Monascus spp.)是一种小型丝状真菌,其分泌的红曲色素、莫纳呵啉K等多种有益次级代谢产物广泛应用于食品添加剂、医药制品等行业。另外,有些红曲菌株会产生一种真菌毒素—桔霉素,这使得红曲菌应用的安全性受到质疑。因此合理利用红曲菌产生的次级代谢产物具有重要的现实意义。组蛋白的乙酰化会减少组蛋白上所带的正电荷,从而使组蛋白与DNA之间的结合能力减弱,导致核小体的结构改变,相关基因表达发生变化,然后生物体通过产生一系列的生物学效应来影响其生命活动。组蛋白去乙酰化酶是一种保守的酶类,它参与核心组蛋白的去乙酰化反应。对多种丝状真菌中组蛋白去乙酰化酶的功能研究表明,它们在真菌的生长、繁殖及次级代谢调控等方面发挥着重要作用。根据红色红曲菌M7的基因组注释信息可知,红色红曲菌M7中有4个组蛋白去乙酰化酶编码基因(Mrhda1、Mrhos2、Mrsir2、Mrrpd3)。本课题在此基础上,构建这4个基因的缺失突变株,得到了菌株△Mrhda1、△Mrhos2、AMrsir2;分析了突变株的生长发育及色素与桔霉素产生能力与原始菌株的区别;并比较了红色红曲菌M7中9个聚酮合酶合成基因在原始菌株和△Mrhda1菌株中表达的差异。主要研究结果如下:1.构建了△Mrhda1、△Mrhos2和AMrsir2 菌株根据反转录PCR分析结果可知,红色红曲菌M7中的4个组蛋白去乙酰化酶基因在转录水平上都得到了表达。构建这4个基因的敲除盒,以pCAMBIA3300质粒为载体,构建基因敲除载体,通过根癌农杆菌介导的转化方法将敲除载体携带的敲除盒整合到红色红曲菌M7基因组中,通过PCR和Southern blot验证突变株,最后得到了 AMrhda1、△Mrhos2 和AMrsir2 菌株。2.分析了△Mrhda1、AMrhos2和AMrsir2菌株生长发育及色素与桔霉素产生特征对红色红曲菌 M7 及AMrhda1、△Mrhos2、AMrsir2 菌株在 PDA、G25N、CYA和G25N培养基上菌落形态和显微形态进行比较分析,结果表明:与原始菌株相比,AMrhda1菌株菌落颜色红色偏深,这一现象在PDA和G25N培养基上表现得更为明显;△Mrhos2菌株菌落颜色红色偏浅,这一现象在CYA和MA培养基上表现得很明显。在PDA培养基上,△Mrhda1和△Mrhos2菌株菌落外周基本不产生气生菌丝。原始菌株和突变株在PDA和MA培养基上都能产生闭囊壳,在G25N和CYA培养基上都能产生分生孢子。将红色红曲菌M7及△Mrhda1、AMrhos2、△Mrsir2菌株接种到PDB培养基中,对发酵过程中的一些基本特征进行分析。结果表明:在每个检测时间点,△ Mrsir2菌株的生物量稍高于原始菌株。另外,△Mrhda1菌株的红曲色素和桔霉素产量明显高于原始菌株;AMrhos2菌株的红曲色素和桔霉素产量明显低于原始菌株;△sMrsir2菌株的红曲色素和桔霉素产量与原始菌株相比没有规律性的区别。由以上结果可知,组蛋白去乙酰化酶会影响红色红曲菌M7的生长发育及色素与桔霉素的产生能力,并且不同类型的酶的影响效果不同。3.分析了聚酮合酶基因在AMrhda1菌株中的转录丰度变化分别选取红色红曲菌M7和△Mrhda1菌株在PDB培养基中培养不同时间的菌丝体作为实验材料,利用Real-time RT-PCR对两株菌中的9个聚酮合酶合成基因在转录水平上的表达情况进行分析。结果表明:在测定时间内,参与红曲色素合成的pks基因和桔霉素合成的pks基因在△Mrhda1菌株中一直高于在原始菌株中的转录水平,而编号为GME1661的pks基因均低于在原始菌株中的转录水平,剩余6个基因的转录水平在不同时间点或高于原始菌株或低于原始菌株,没有确定的趋势。可见,组蛋白去乙酰化酶Hda1对红色红曲菌M7中不同pks基因的转录调控作用不同。