论文部分内容阅读
目的:基于“五味合化”理论,采用全基因芯片技术探索人参乌梅汤加味(酸甘化阴法)对腹泻模型大鼠结肠差异基因的分子调控机制。方法:84只幼龄SD大鼠适应性喂养2d后,随机抽取12只为空白组(A组),予以生理盐水灌胃(30ml/kg,1次/d)。剩余72只为造模组,参考文献方法,采用苦寒泻下、劳倦力竭复合方法制作腹泻模型。予以25%番泻叶灌胃(20ml/kg,1次/d);灌胃30min后,大鼠入水游泳(水深40cm,水温30℃,尾部负重约其体重5%铅丝),至力竭(大鼠鼻尖没水5s)后捞出烘干;连续造模21d。参考文献方法评定造模成功后,随机分为模型组(B组)、西药组(D组)、全方组(人参乌梅汤加味全方,E组)、去甘味药组(人参乌梅汤加味去甘味药,F组)、去酸味药组(人参乌梅汤加味去酸味药,G组)、去辛味药组(人参乌梅汤加味去辛味药,H组),每组12只;分别予以生理盐水(30ml/kg,1次/d)、5%妈咪爱(0.7g/kg,1次/d)、人参乌梅汤加味全方、人参乌梅汤加味去甘味药、人参乌梅汤加味去酸味药、人参乌梅汤加味去辛味药(各中药组用法均为35g/kg,1次/d)灌胃,连续干预7d。观察造模及干预过程中大鼠一般情况。干预7d后处死大鼠,分别取材送检。(1)取结肠组织经10%甲醛固定液固定,常规HE染色,组织切片光镜下观察结肠病理形态。(2)取结肠组织经RNA保存液固定,进行RNA抽提、质检、纯化、放大标记后,采用Agilent大鼠全基因4*44K芯片进行杂交扫描,对芯片原始数据归一化处理后统计筛选各组间差异基因(FC≥2,p<0.05);采用GO功能、KEGG pathway富集分析方法对差异基因进行生物信息学分析,初步阐释差异基因相关生物功能。(3)筛选组间重叠差异基因,采用实时荧光定量PCR技术验证芯片实验结果,并统计分析。结果:(1)结肠病理形态观察:西药组、全方组可有效缓解腹泻大鼠一般表现和腹泻情况,并能明显改善腹泻大鼠结肠粘膜溃疡、充血、水肿、炎性浸润等反应,对粘膜具有促损伤修复能力;去甘味药组、去酸味药组、去辛味药组肠粘膜损伤表现不同程度改善,损伤程度较模型组轻。(2)全基因芯片实验及生物信息学分析:(1)模型组与空白组相较,获得差异基因34个,其中上调基因10个,下调基因24个;GO富集获得123个条目,其中生物学过程92条(显著富集(p<0.05)44条),主要涉及离子转运、离子稳态、发育调节、细胞分化、信号转导、细胞增殖等;pathway富集获取21条通路,主要涉及肥厚型心肌病(HCM)、心肌收缩、MAPK信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路等。(2)西药组与模型组相较,获取差异基因16个,其中上调基因6个,下调基因10个;GO富集获得5个条目,其中生物过程2条(无显著富集),涉及细胞过程调节;pathway富集获得2条通路,涉及嗅觉转导、RNA降解。(3)全方组与模型组相较,获得差异基因51个,其中上调基因17个,下调基因34个;GO富集获得125个条目,其中生物过程80条(显著富集12条),主要涉及损伤反应、信号转导、转录调控等;pathway富集获得21条通路,主要涉及神经活性配体-受体相互作用、嗅觉转导、赖氨酸降解、蛋白质的消化和吸收、味觉转导、钙信号通路等。(4)去甘味药组与模型组相较,获得差异基因45个,其中上调基因19个,下调基因26个;GO富集获得72个条目,其中生物过程35条,主要涉及对其他有机体的反应、对外部生物刺激的反应等;pathway富集获得37条通路,主要涉及吞噬、嗅觉转导等。(5)去酸味药组与模型组相较,获得差异基因145个,其中上调基因71个,下调基因74个;GO富集获得411个条目,其中生物学过程306条,主要涉及脂质代谢过程的负调控、对干扰素-γ的反应等;pathway富集获得53条通路,主要涉及原发性免疫缺陷、胞质DNA传感通路等。(6)去辛味药组与模型组相较,获得差异基因126个,其中上调基因52个,下调基因74个;GO富集获得574个条目,其中生物学过程439条,主要涉及雄激素生物合成过程、C21类固醇激素生物合成过程等;pathway富集获得73条通路,主要涉及类固醇激素生物合成、色氨酸代谢等。与模型组相较,各拆方组获得差异基因参与的生物功能以去辛味药组最多,各拆方组获得的差异基因及参与的生物功能与全方组比较同时存在相似和不同;所有中药组差异基因及涉及的生物过程、通路均多于西药组。各拆方组与全方组相较,去辛味药组差异基因最少。(3)RT-PCR验证实验:筛选出Nlrp6、Tmem66、Gng10、Shc1、Ctnnb1、Trpm7、Vamp7、Gnas作为验证基因。验证基因经扩增后的整体表达趋势与基因芯片实验结果具有较好的一致性。验证基因经扩增后,与空白组相较,模型组中Gng10、Trpm7差异有统计学(p<0.05),表达上调;与模型组相较,全方组中Nlrp6、Tmem66差异有统计学意义(p<0.05),表达下调;且均与芯片实验结果一致。结论:(1)人参乌梅汤加味对腹泻模型大鼠结肠粘膜具有促损伤修复作用。(2)提示腹泻具有多基因、多途径的发病特点。CHRNA7下调影响钙离子调控,CACNA2D3下调、IL1R2上调影响MAPK信号通路,可能参与腹泻的发生发展。(3)初步证明人参乌梅汤加味(酸甘化阴法)可通过调控腹泻模型大鼠结肠差异基因的表达发挥益气生津止泻效应。人参乌梅汤加味复方可能通过下调F2RL3、GHR影响神经活性配体-受体相互作用途径,上调SUV39H2影响赖氨酸降解途径,下调XPNPEP2影响蛋白质的消化和吸收途径发挥治疗效应。(4)结合课题组前期人参乌梅汤加味复方指纹图谱研究基础,提示酸味药+甘味药的配伍合化作用是人参乌梅汤加味复方发挥止泻效应的主要物质基础,并体现了中药复方多成分、多基因、多途径的复杂作用特征。(5)RT-PCR验证实验证实基因芯片实验结果可靠,将Gng10、Trpm7、Nlrp6、Tmem66作为腹泻发病及治疗的分子靶点研究具有一定的潜在价值。