背景与目的缺氧导致的神经元死亡主要有细胞坏死和细胞凋亡两种机制,但是缺氧的速度决定了神经细胞的死亡方式。如在缺血性脑卒中后,核心梗死区的神经细胞以坏死为主,而在缺血半暗带内的神经细胞则出现凋亡与坏死共同存在。细胞凋亡是由于细胞自身对周围环境和自身所处的内环境的生理性与病理性的刺激信号,当这些环境条件发生变化或者出现缓和性的损伤,因此细胞本身产生的应答而开始出现有序的变化直至死亡的过程。凋亡在神经元中产生的机制是由于葡萄糖或/和氧气的缺乏破坏神经细胞内外的离子浓度梯度,导致神经细胞的去极化,去极化的神经细胞会消耗大量的能量重新极化导致葡萄糖或/和氧气的进一步缺乏,这一过程呈恶性循环,直至神经细胞内能量耗竭而死亡。许多研究发现神经元凋亡时间从数小时至数周不等。缺血性卒中是指因局部脑组织的动脉血液循环障碍,缺血、缺氧所致的神经细胞的死亡,是脑血管病中最常见的一种类型。在缺血性卒中中,大面积脑梗死是最严重类型之一,高死亡率、高致残率是其突出特点。N-myc下游调控基因(NDRG)家族蛋白包含4个成员:NDRG1-NDRG4,通过进化被很好的保留了下来。它们由大约340-394个氨基酸残基组成,拥有约53-65%共同基因序列。所有的家族成员的共同特征是均具有一个NRD-结构和一个α/β折叠水解酶结构域。越来越多的研究表明:NDRG家族蛋白成员在生长发育、免疫反应、内分泌调节、肿瘤基因的调控、乳酸诱导的缺氧信号转导中扮演着重要的角色。多种神经病学和神经电生理上的综合征与NDRG家族基因缺陷有关。在大脑中,NDRG3和NDRG4的表达是普遍存在的,NDRG3在大脑和小脑的大多数细胞核中表达,而NDRG1和NDRG2的表达则分别位于少突神经胶质细胞和星形神经胶质细胞中。在小脑中,NDRG1和NDRG4主要分布在浦肯野细胞中,NDRG2分布在Bergmann神经胶质细胞中。周围神经中,NDRG1集中在髓鞘施旺氏细胞的细胞质中。机体在大多数内环境稳定和病理环境中必须能对缺氧产生反应。众所周知,由缺氧诱导因子(HIF)所介导的缺氧反应调节已经被确定,但是有证据显示其他的不依赖于缺氧诱导因子的机制也参与了缺氧反应的调节。研究已经确定了一条在缺氧状态下的乳酸依赖的信号传导通路,由氧和乳酸调节蛋白NDRG家族成员NDRG3介导,其参与缺氧反应的调节不依赖于缺氧诱导因子。乳酸是一种在缺氧条件下增多的代谢产物。研究发现在正常氧环境下NDRG3蛋白的表达下降,氧通过一种依赖PHD2/VHL的方式负性调节NDRG3蛋白水平的表达,证实了 NDRG3是一个真正的PHD2/VHL系统氧调节底物。然而,在缺氧条件下,随着时间的延长会大量产生乳酸,NDRG3蛋白经由累积的乳酸结合受到保护免于破坏。稳定的NDRG3蛋白与c-Raf结合后介导缺氧诱导的Raf-ERK通路的激活。研究也发现在缺氧条件下稳定的NDRG3蛋白通过Raf-ERK通路会促进血管再生和细胞生长。抑制细胞产生乳酸就消除了 NDRG3介导的缺氧反应。NDRG3充当缺氧诱导的乳酸感受器,在促进缺氧反应中扮演关键角色,这个过程并不依赖HIF。NDRG3-Raf-ERK轴为乳酸诱导的缺氧信号提供了遗传基础,除了能提高我们对缺氧性疾病机制进一步理解,而且能被开发用于针对那些缺氧诱导疾病的治疗。NDRG3作为一种氧调节蛋白,在促进缺氧反应中扮演关键角色,因此本文对乳酸-NDRG3-Raf-ERK信号通路中的NDRG3蛋白在大面积脑梗死患者中的表达变化及其意义做一初步研究。在本研究中,我们分别在体外、大鼠脑梗死模型以及大面积脑梗死患者中检测NDRG3的表达。体外实验发现,NDRG3的表达随缺氧时间延长而增多,在缺氧后期其表达量逐渐下降。同样在大鼠脑梗死模型和大面积脑梗死患者中,NDRG3的表达水平在一定时间内随梗死的时间延长而增多,缺氧后期表达下降。推测NDRG3蛋白的表达变化机制可能是由于缺氧以及糖酵解增加导致的局部组织中的高乳酸浓度强烈诱导了 NDRG3蛋白的表达。因NDRG3蛋白可通过激活Raf-ERK通路促进血管再生和缺氧细胞的生长,为局部组织中的细胞提供自给自足的机制,使其可以从缺氧中恢复而不需要额外的细胞外信号,推测在大面积脑梗死中,NDRG3可能是一种保护性蛋白。因此调控NDRG3表达可能成为未来治疗大面积脑梗死的一种有效的策略。材料与方法:1.大脑皮层神经元原代培养:选取新生24小时以内的SD大鼠乳鼠,提取其皮层神经元细胞进行原代培养。皮层神经元缺糖缺氧(OGD)处理:将细胞培养孔板中的细胞培养基更换为无糖平衡盐缓冲液,放置于37℃的恒温箱中的密封缺氧盒中(95%N2/5%CO2的混合气体),缺氧缺糖处理0.5小时、6小时、12小时后用4%的多聚甲醛固定。检测各组细胞内NDRG3蛋白的表达水平:采用细胞免疫荧光法观察皮层神经元中NDRG3的表达情况,应用western blot方法对NDRG3蛋白的表达情况进行半定量测定。2.SD大鼠大面积脑梗死模型建立,即栓塞大鼠大脑中动脉形成大面积脑梗死,应用免疫组化法检测NDRG3蛋白的表达部位,选取大脑中动脉梗死后24小时、48小时、72小时及1周为时间点,应用western blot法对脑梗死组织中NDRG3蛋白进行半定量测定,并与正常对照组对比。3.采用前瞻性队列研究的方法,连续收集入住NICU的大面积脑梗死患者30例(CT显示梗死面积大于大脑中动脉供血区的50%和MR DWI提示梗死体积>145cm3),同时随机选取30名正常人作为正常对照组。大面积脑梗死患者在发病24小时、48小时、72小时及1周时抽血留取血清学标本,正常对照组抽血留取血清学标本,应用ELISA试剂盒分别测定正常对照组及大面积脑梗死组血清NDRG3蛋白的表达量并进行对比。结果:1.大鼠皮层神经元内NDRG3蛋白在缺氧情况下,随着缺氧时间的延长,NDRG3蛋白的表达量较不缺氧时会先升高后下降。2.NDRG3蛋白在大面积脑梗死模型SD大鼠大脑中的表达随梗死时间延长而增加,72小时时达到高峰,一周时表达较72小时下降,但均高于正常对照组。3.NDRG3蛋白在大面积脑梗死患者血清中的表达随脑梗死时间延长逐渐增加,72小时达到高峰,一周时表达较72小时下降,但均高于正常对照组。结论:1.无论在体外还是在体内神经细胞中,缺氧都可诱导NDRG3蛋白表达增加。2.在神经细胞中,NDRG3是一种乳酸依赖性的氧调节蛋白。3.NDRG3蛋白在缺氧的神经细胞中表达增多,推测增加的NDRG3蛋白可能对缺氧的神经细胞起到保护性作用,这种机制可能是通过激活Raf-ERK通路促进血管再生和缺氧细胞生长而实现的。