目的和意义本课题组的前期研究提示CD24参与了结直肠癌的进展过程。我们的体外实验证实,CD24可以通过调节ERK1/2促进结直肠癌细胞的增殖与侵袭。CD24分子因缺乏跨膜结构而不足以传递细胞信号,而Src家族激酶和MAPK通路关系密切且和肠癌密切相关。因此,本研究探讨了Src家族激酶成员之一的Lyn在CD24所诱导的ERK1/2的激活过程及其在结直肠癌进展过程中的作用。这对于明确结直肠癌发生发展分子机制,为结直肠癌的早期诊断和个体化治疗寻找新的分子标志都具有重要的意义。材料和方法1、主要材料SW480及SW620细胞株为南方医院消化病研究所细胞培养室保存；pcDNA3.1(+)-CD24质粒、pcDNA3.1(+)空载体(Vector)由南方医院消化病研究所提供。RPMI-1640培养基(GIBCO), LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)、Opti-MEM (Invitrogen)、RT-PCR试剂盒(Invitrogen)、G418 (Calbiochem)、PP2抑制剂(Sigma)、Cell invasion Kit (Millipore)、免疫组化SP试剂盒(福州迈新生物公司)、CD24 (C-20) (Santa Cruz)、ERK1/2 (137F5) (Cell Signaling Technoly)、p-ERK (E-4) (Santa Cruz)、GAPDH (Santa Cruz)、p38 MAPK (CellSignaling Technoly)、phospho-p38 MAPK (Cell Signaling Technoly). SAPK/JNK (Cell Signaling Technoly)、phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (Cell Signaling Technoly)、Lyn (Cell Signaling Technoly)、p-Lyn (Y396) (Abcam)、Src (Cell Signaling Technoly)、p-Src (Tyr416) (Cell Signaling Technoly)、抗兔HRP标记二抗(中杉金桥)、抗羊HRP标记二抗(中杉金桥)、FITC荧光标记二抗(Thermo)。202例结直肠癌及癌旁正常黏膜的石蜡包埋组织标本。2、主要方法2.1细胞培养SW480及SW620细胞应用含有10% FBS的RMPI-1640完全培养液进行培养,而SW480VEC、SW480CD24(由南方医院消化实验室所提供)则用600μg/mlG418的含有10% FBS的1640培养基培养,均置于5%C02、37℃、湿度充分条件下进行常规培养。2.2重组pcDNA3.1(+)-CD24质粒瞬时转染SW480细胞六孔板中细胞生长至70%左右融合时,按Invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书将质粒导入SW480细胞,转染6h后改用10%FBS的1640培养基;48h后改用含1000μg/ml G418、10% FBS的1640培养基连续筛选,挑取单克隆后继续扩大培养,用RT-PCR和Western blotting鉴定目的基因(CD24)的表达。2.3 RT-PCR检测CD24 mRNA水平按Invitrogen的Trizol的说明书提取细胞总mRNA,使用Invitrogen公司逆转录试剂盒,按说明书将mRNA逆转录为cDNA, PCR扩增CD24目的片段与内参GAPDH片段,说明书的PCR体系进行加样,反应条件反应条件为：94℃预变性5min,然后进入以下36个循环：94℃变性45s,56℃退火50s,72℃延伸50s；循环完毕,72℃延伸7min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。电泳条件为,恒压80V,约30min。2.4 Western blotting细胞按实验目的处理后,去除培养基并应用预冷的1×PBS清洗贴壁细胞2次,细胞皿中加入预冷的RIPA细胞裂解液(含有1：1000的PMSF、1：100的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)。将裂解产物转移1.5mL离心管中,冰上放置30min,间断振荡5-6次,4℃,20000g,离心15min,取上清液,BCA法测定蛋白浓度后,加入SDS上样缓冲液,煮沸5min,于-20℃保存。将蛋白(上样量30ug)加入SDS-PAGE凝胶泳道中(10%分离胶和5%浓缩胶)进行电泳,湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,应用TBST(含0.1%吐温20)配置的5%(w/v)脱脂奶粉室温封闭1h,按抗体说明书要求加入相应浓度的一抗,4℃,振荡摇床过夜；去除一抗后,孵育相应HRP结合的二抗(1：5000),移除二抗并充分洗涤后,应用ECL发光液进行发光。2.5免疫共沉淀实验按实验目的对细胞进行处理,于48h之后应用免疫沉淀RIPA裂解液进行蛋白提取,4℃,14000g,离心15min,所得上清转移至新的1.5mL离心管中,取少量上清作为阳性对照；剩余上清则按要求加入相应的一抗,4℃,振荡摇床过夜；再加入ProteinA/G珠,继续于4℃摇床振荡,约4h；将离心管快速离心,去除上清,珠子应用免疫沉淀裂解液进行洗涤,约6次,最后再加入20μ1的2X上样缓冲液,煮沸,5min。正常兔血清作为阴性对照组。按前述方法进行蛋白印迹实验。2.6细胞免疫荧光将细胞接种于底部铺有无菌盖玻片的六孔板中,按实验目的对细胞进行处理。待所需时间过后,小心取出盖玻片,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定细胞10min,PBS洗涤3次；正常兔血清或羊血清封闭60min；按要求加入相应一抗,4℃,置于摇床过夜；PBS洗涤3次,加入FITC或CY3荧光二抗(避光),孵育1h,PBS洗涤3次,最后加入lml的DAPI染料进行核染,PBS洗涤3次,抗淬灭荧光封片剂封片,于荧光显微镜下进行观察。2.7细胞侵袭实验应用细胞侵袭实验试剂盒(ECM, Millpore)来评价细胞的侵袭能力。按实验目的处理细胞后,依照说明书要求应用无血清1640培养基制备细胞悬液,密度为1.0×106/ml,300μl的细胞悬液加入到Transwell小室的上室中,同时加入在其下室加入500μl含10%FBS的1640培养基。24h后,用棉签檫去上室残留的细胞,0.1%结晶紫进行染色,PBS充分洗涤。显微镜下(100X)随机选取6个视野进行细胞计数。SPSS13.0软件进行统计分析。2.8免疫组织化学染色(SABC法)检测CD24、Lyn在结直肠癌组织中的表达情况应用链霉亲和素-生物素辣根过氧化物复合物法(SABC法)：结直肠癌组织的连续切片(4umm)经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后,3%H202灭活内源性过氧化物酶,室温10 min；微波抗原修复；正常兔血清封闭液,室温20 min。滴加一抗,4℃孵育过夜；滴加二抗,37℃孵育15 min；滴加SABC试剂,37℃孵育20 min；DAB显色,镜下掌握显色程度,苏木素复染1 min,盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。每次实验均以已知阳性组织切片为阳性对照,以PBS缓冲液为一抗作阴性对照。所有结果由两个病理科高级医师独立阅片评分。2.9统计学分析结果均经SPSS 13.0软件统计分析。细胞侵袭实验中,各组侵袭细胞数比较采用One-Way ANOVA (Bonferroni多重比较)。免疫组化各分子染色强度(等级资料)在性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移及有无远处转移分布差异,使用两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验；在肿瘤部位的分别差异,使用多个独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验；与肿瘤分级、肿瘤分期、浸润深度的关系,使用Spearman秩相关检验。免疫组化染色的两分子之间的相关性采用Spearman秩相关检验。采用Kaplan-Meier法及log-rank检验进行影响预后的单因素分析,对符合条件的纳入COX比例风险模型进行多因素分析。所有的统计结果选取检验水准a=0.05；参数比较前进行方差齐性检验,在方差齐性的基础上进行比较。结果1、SW480细胞过表达CD24后可激活p-Lyn、p-ERK1/2和p-p38SW480细胞株为低表达CD24的细胞株,我们将pcDNA3.1(+)-CD24质粒转染进入SW480细胞,并检测Src家族、MAPK家族中关键分子的蛋白水平和磷酸化水平的变化情况。在转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞中,Lvn、ERK1/2和p38的磷酸化水平与SW480和SW480vec细胞相比具有明显的增加而Src和JNK1/2激酶的活性无显著性差异。这提示我们,CD24可能对于Src家族成员之一的Lyn、MAPK家族中ERK1/2及p38激酶的活性均有重要的调节作用。2、抑制Lyn的活性后,由CD24所诱导ERK1/2的活性亦受到抑制由于上调SW480细胞的CD24表达后,Lyn、ERK1/2及p38的活性均有升高,因此我们在转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞中分别加入不同浓度(0μM、5μM、10μM、20μM)的Src家族特异性抑制剂PP2来抑制Lyn的活性,通过Western Blot检测加入PP2抑制剂后,Lyn、ERK1/2和p38的活性变化情况。在加入不同浓度的PP2抑制剂后,SW480CD24细胞中Lvn和ERK1/2的磷酸化水平与DMSO对比组细胞相比受到了抑制,且其活性变化与PP2抑制剂呈剂量依赖性关系,而p38的活性则无显著性差异：PP2抑制剂特异性的抑制Lyn活性后由CD24所诱导的ERK1/2的活性亦受到抑制,这提示Lyn与ERK之间可能存在着上下游的调节关系。3、同时沉默CD24表达与应用PP2抑制剂对于由CD24所诱导的Lvn、ERK1/2的活性具有协同的抑制作用为了进一步明确CD24对于Lyn、ERK及p38激酶活性的调节作用,以及它们之间的相互调节关系,我们应用CD24siRNA沉默CD24的表达和/或PP2抑制剂处理SW480CD24细胞,再通过Western Blot检测p-Lyn、p-ERK及p-p38活性的变化。在转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞中,CD24siRNA沉默CD24的表达后可以下调p-Lyn、p-ERK1/2和p-p38的活性,PP2抑制剂可下调Lyn、ERK1/2的活性；且CD24-siRNA和PP2抑制剂的同时应用,对于p-Lyn、p-ERK1/2的活性具有协同抑制作用。同时,在高表达CD24的SW620细胞株中经CD24siRNA沉默CD24的表达后可以下调其Lyn、ERK1/2和p38的活性,PP2抑制剂可下调Lyn、ERK1/2的活性。而前述实验已经证实,当PP2抑制剂抑制Lyn的活性后ERK1/2的活性亦受到抑制。因此,CD24可能是首先通过激活Lyn后从而再激活ERK1/2的活性的,它们三者之间可能存在着上下游的调节关系。4、CD24与Lyn、Lyn与ERK1/2之间的存在相互作用,且Lyn与ERK1/2之间的存在相互作用依赖于CD24上述实验提示,CD24、Lyn及ERK1/2三者之间可能存在着上下游的调节关系。为了进一步明确CD24、Lyn及ERK1/2之间是否存在着相互作用,我们应用免疫共沉淀(CO-IP)实验对转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞和高表达CD24的SW620细胞株中的CD24、Lyn及ERK1/2的相互作用进行了分析。转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞与空载体VECTOR的SW480VEC细胞中均存在着CD24与Lyn的相互作用；CD24siRNA沉默SW620细胞的CD24的表达后亦可检测到CD24与Lyn的相互作用。转染空载体VECTOR的SW480VEC细胞中未检测到Lyn与ERK1/2的相互作用；而转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞与高表达CD24的SW620细胞株中中均存在着Lyn与ERK1/2的相互作用；CD24-siRNA沉默SW620细胞的CD24的表达后并未检测到Lyn与ERK1/2的相互作用,因此可能Lyn与ERK1/2之间的存在相互作用依赖于CD24的作用。5、调节CD24的表达可引起Lyn在细胞中发生转位作用因Lyn与ERK1/2之间的存在相互作用依赖于CD24的作用,应用细胞荧光实验进一步的验证转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞和高表达CD24的SW620细胞株中的Lyn、ERK1/2的定位情况。与转染空载体VECTOR的SW480VEC细胞相比,转染了pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞中的Lyn可转位至细胞核中,亦可见ERK1/2可于细胞核中有增多；同时分别提取其浆蛋白及核蛋白检测Lyn的表达变化情况,与空载体组相比,转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞的Lyn在细胞核中表达明显增加。高表达CD24的SW620细胞株中的Lyn亦可定位于细胞核中,沉默其CD24的表达后Lyn于细胞核中的表达可减少。6、CD24和Lyn可参与调节结直肠癌细胞的侵袭过程Transwell侵袭实验结果提示,与SW480细胞和转染空载体VECTOR的SW480vEc细胞相比,转染了pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞穿至下室的数量明显增多(P=0.000)。同时,转染pcDNA3.1(+)-CD24质粒的SW480CD24细胞或高表达CD24的SW620细胞应用PP2抑制剂抑制Lyn活性或CD24siRNA沉默CD24表达后均可抑制其侵袭作用(P=0.000)；且在这两种细胞中PP2抑制剂和CD24siRNA的联合应用可协同的抑制细胞的侵袭(P=0.000)。CD24和Lyn可能与结直肠癌细胞的侵袭过程的调控有关。7、CD24和Lyn在结直肠癌组织中的有不同程度表达情况,二者的表达呈正相关关系,且与结直肠癌临床病理特征关系密切结直肠癌组织中的免疫组化染色显示,CD24、Lyn在结直肠癌组织中有不同程度的染色,而癌旁正常结直肠粘膜则为阴性表达。CD24、Lyn在结直肠癌组织有不同程度的染色；CD24在结直肠癌组织中约40%为中等阳性表达,9%为强阳性表达；而Lyn约35%为中等阳性表达,9%为强阳性表达。为了明确CD24和Lyn在组织中的关系,组织连续切片提示CD24、Lyn的表达情况有相关性,应用Spearman相关分析统计提示CD24表达与Lyn表达呈正相关关系(r=0.443,P=0.000)。CD24表达与结直肠癌分化程度(r=0.255,P=0.000)、肿瘤分期(r=0.577,P=0.000)、肿瘤浸润程度(r=0.293,P=0.000)、淋巴结转移(Z=-6.770,P=0.000)以及远处转移(Z=-6.805,P=0.000)之间有统计学意义,而与患者性别(Z=-0.336,P=0.737)、年龄(Z=-1.407,P=0.159)、肿瘤部位(χ2=0.020,P=0.990)以及肿瘤大小(Z=-0.333,P=0.739)之间则无统计学意义。同样的,Lyn表达与结直肠癌分化程度(r=0.233,P=0.000)、肿瘤分期(r=0.399,P=0.000)、肿瘤浸润程度(r=0.297,P=0.000)、淋巴结转移(Z=-5.516,P=0.000)以及远处转移(Z=-4.694,P=0.000)之间有统计学意义,而与患者性别(Z=-0.749,P=0.454)、年龄(Z=-0.698,P=0.485)、肿瘤部位(z2=1.217,P=0.544)以及肿瘤大小(Z=-0.759,P=0.448)之间则无统计学意义。这进一步证实了体外实验的结果。8、CD24和Lyn表达与患者预后关系密切,CD24表达可以作为独立影响结直肠癌预后的因素202例结直肠癌患者中,有74例病例有随访数据,随访1-60个月,而128例病例因各种原因并未进行随访。单因素生存分析法(Kaplan-Meier)提示,CD24低表达组与高表达组之间的生存率有统计学差异,高表达组的生存率较低表达组低(χ2=14.546,P=0.000,log-rank检验)；Lyn低表达组与高表达组之间的生存率有统计学差异,高表达组的生存率较低表达组低(χ2=12.559,P=0.000,log-rank检验)。Cox模型多因素分析结果提示,CD24的表达情况可以做为影响结直肠癌患者预后的独立因素(P=0.020,相对危险度为2.918,95%可信区间为1.188-7.166)。结论本研究通过体外细胞学实验提示,CD24在结直肠癌细胞株中可以通过激活p-Lyn后而进一步激活p-ERK1/2；CD24与Lyn、Lyn与ERKl/2之间存在着相互作用的关系；上调结直肠癌细胞的CD24的表达后可促进Lyn的细胞核转位；所以CD24可能是通过调节Lyn从而促进结直肠癌细胞的侵袭作用的。免疫组织化学实验的结果提示,在结直肠癌组织中CD24、Lyn的表达与肿瘤的分化程度、肿瘤分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移以及远处转移情况之间有统计学意义(P=0.000),且二者的表达具有正相关关系(r=0.443,P=0.000)。CD24可以作为影响结直肠癌预后的独立因素(P=0.020,相对危险度为2.918,95%可信区间为1.188-7.166)。这些结果提示CD24在结直肠癌的进展过程中有着重要的作用,CD24与Lyn之间的相互作用关系可能在促进结直肠癌细胞的侵袭的过程中起着重要的作用。CD24与Lyn之间的相互作用可能是调节结直肠癌细胞侵袭过程的一种新机制。这为完善结直肠癌发病机制的信号传导通路理论,并为新的分子靶标的确立提供实验数据,同时对结直肠癌患者的个体化治疗也都具有重要的意义。