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研究背景缺血性心脏病(IHD)是威胁人类健康的重大疾病之一。缩短组织缺血时间、尽早恢复血流灌注是防治缺血损伤最有效的措施。溶栓、经皮冠状动脉成形术和冠状动脉旁路移植术等血管再通术可有效地恢复缺血组织的供血,但上述疗法都存在一个心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的问题。大量证据表明,MI/R早期即出现内皮功能障碍,内源性一氧化氮(NO)生成量降低,该变化可诱发中性粒细胞激活,加剧心肌损伤。我们及其它实验室前期工作均表明,NO具有扩张小血管、改善缺血心肌灌注、抗炎、抗凋亡等作用。因此,临床上常用硝酸酯类药物作为外源性NO供体减轻MI/R损伤。此外,MI/R早期的氧自由基(ROS)大量生成,通过脂质过氧化反应破坏心肌细胞膜是造成心脏损伤的最主要的原因之一。ROS通过诱发血管内皮损伤导致内皮型NO合成减少,并可直接造成膜的通透性增加、细胞内Ca2+超载和炎症介质产生。而在MI/R时,内源性自由基清除酶系统活性是降低的。因此,阿魏酸(FA,结构式见图1A)这样的自由基清除剂也被用于IHD的治疗。再灌注时过度生成的ROS不仅造成心脏损伤,而且导致内皮型NO生成量降低,加重心肌损伤。那么,我们设想,一种兼具清除ROS和释放NO的药物是否对缺血/再灌注心肌具有更好的保护作用呢?为此,我们设计并合成了一种可在体内同时清除ROS和释放NO的药物——乙酰阿魏酸单硝酸异山梨醇酯(AFI,结构式见图2),并研究其在MI/R损伤中的心肌保护效果。研究目的1.获得一种可在体内同时清除ROS和释放NO的新型抗MI/R损伤药物结构。2.探讨这种新化合物在MI/R损伤中是否具有比NO供体和自由基清除剂更好的心肌保护效果。实验方法1. FA与乙酸酐进行乙酰化反应后,再与ISMN发生酯化反应,最后,柱层析分离得到目标产物AFI,红外、核磁和质谱表征结构。(此部分工作在药化教研室完成)2.制备大鼠心肌缺血模型,缺血30分钟,再灌注3小时。将大鼠随机分为以下6组:(1)假手术组(SHAM);(2)心肌缺血/再灌注(MI/R)组(I/R);(3) MI/R +阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)组(SF,40 mg/kg);(4) MI/R + ISMN组(ISMN,30 mg/kg);(5) MI/R + SF+ISMN组(SF,40 mg/kg;ISMN,30 mg/kg);(6) MI/R + AFI组(AFI,10 mg/kg)。持续监测大鼠心电图、左室发展压(LVDP)、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率(±dP/dtmax)。采用比色法检测再灌注3 h后血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、NO水平。采用伊文思蓝和红四氮唑(TTC)双染色法检测再灌注3 h后心肌梗死面积。实验结果1.原料FA经乙酰化和酯化反应得到最终产物AFI,总产率73%。产物熔点162.5 ~ 163℃,红外、核磁和高分辨质谱鉴定表明产物与目标结构相符。2.做AFI剂量对血清中NO含量影响的量效曲线(n = 6),求得半数最大效应浓度为7.02 mg。3. AFI促进MI/R心脏功能恢复再灌注后,各组间心率(HR)无统计学差异;SF(n = 8, P < 0.05)、ISMN(n = 8, P < 0.01)、SF+ISMN(n = 8, P < 0.01)和AFI(n = 8, P < 0.01)均使LVDP较I/R组有显著升高,AFI组较SF+ISMN组也有明显升高(P < 0.05);左室内压微分也有相似趋势,SF、ISMN、SF+ISMN和AFI均使±dP/dtmax较I/R组有显著升高(n = 8, P均小于0.01),AFI组较SF+ISMN组也有明显升高(P < 0.05)。可见,AFI可以改善缺血心肌的心功能,而且保护作用强于联合使用SF与ISMN。4. AFI减轻心肌损伤缺血30 min再灌3 h造成大鼠明显心肌梗死,SF、ISMN、SF+ISMN及AFI组较I/R组有明显缩小[(39±5) %、(36±7) %、(36±5) %和(21±8) % vs. (56±6) %, n = 8, P < 0.01],而AFI组心肌梗死范围较SF+ISMN组也有明显缩小(P < 0.05)。上述结果表明,AFI还可以减少缺血损伤心肌的梗死,并且这种作用强于联合使用SF与ISMN。血清CK、LDH活性结果显示,与MI/R组比,SF组、ISMN组、SF+ISMN组和AFI组血清中CK活性都明显降低(n = 8, P < 0.01),SF+ISMN组与SF组或ISMN组比较有显著性减少(n = 8, P均小于0.05),AFI组也明显低于SF +ISMN组(n = 8, P < 0.05)。血清中LDH活性也有相似趋势:与I/R组比,SF组(n = 8, P < 0.05)、ISMN组(n = 8, P < 0.01)、SF+ISMN组(n = 8, P < 0.01)和AFI组(n = 8, P < 0.01)都明显降低,SF+ISMN组血清中LDH活性也明显低于SF(P < 0.05)。上述结果提示,AFI可减少缺血心肌细胞死亡,且这种作用强于联合使用SF与ISMN。5. AFI增加NO释放量缺血30 min再灌3 h造成大鼠血清中NO含量较SHAM组有升高,SF组、ISMN组、SF+ISMN组及AFI组较MI/R组也有明显升高(n = 8, SF组P < 0.05,其它各组P均小于0.01),AFI组血清中NO含量较SF组和ISMN组增加,变化有统计学意义(P均小于0.01)。不同处理组大鼠MI/R 3 h后血清中NO含量见表。由结果可见,当AFI组摩尔用药量是ISMN的八分之一时,血清中NO含量即大于ISMN组。6. AFI清除自由基MI/R使血清中SOD活性较SHAM组明显降低,与MI/R组比,SF组(P < 0.05)、SF+ISMN组(P < 0.05)和AFI组(P < 0.01)血清中SOD活性都明显增加,AFI组也明显高于SF(P < 0.01)、ISMN(P < 0.01)和SF+ISMN组(P < 0.05)。MI/R使血清中H2O2含量较SHAM组明显增加,与MI/R组比,SF组、SF+ISMN组和AFI组血清中H2O2含量都明显降低(n = 8,P均小于0.01),AFI组也明显低于SF(P < 0.05)和SF+ISMN组(P < 0.05)。MDA的检测结果与H2O2相似趋势,MI/R使血清中MDA含量较SHAM组明显增加,与MI/R组比,SF组、ISMN组、SF+ISMN组和AFI组血清中MDA含量都明显降低(n = 8,P均小于0.01),AFI组也明显低于SF(P < 0.05)、ISMN(P < 0.01)和SF+ISMN组(P < 0.05)。NO以及SOD、H2O2和MDA检测结果提示,AFI保护缺血心肌可能与其释放NO并减少ROS对细胞损伤有关。结论1.实验验证:以FA为原料经乙酰化、酯化反应得终产物AFI,产率73%,路线简单、操作方便、后处理容易、成本低廉。2.由NO供体ISMN和ROS清除剂药物SF合成的新化合物AFI,可以改善MI/R心脏功能,减轻心肌损伤,为MI/R心脏提供NO,清除再灌注过程中产生的ROS,且效果较单独以及联合使用ISMN和SF治疗得以提高。