农杆菌介导的PStVcp基因反向序列遗传转化花生的研究

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花生是我国主要油料作物,其品质改良育种对国民的生产实践具有重要的意义。在已报道的侵染花生的近20种病毒中,花生条纹病毒(PS tV)在我国分布最广,花生条纹病田间发病率最高,是重要的花生病害,严重影响花生的产量和品质。目前在花生及其近缘种尚未发现抗性种质,单纯通过常规育种无法解决该问题,而通过基因工程技术将外源抗病基因转入花生栽培种则具有一定的可行性。本研究通过花生条纹病毒外壳蛋白的反向序列在花生中的遗传转化研究,初步建立了花生的转化体系,并进行了初步的抗病性实验: 1 对影响花生遗传转化效率的外植体防褐化、Kan筛选压、农杆菌共培养时间等重要因素进行了研究。 2 采用农杆菌转化花生,成功地将 PStVcp 反向重复序列导入花生。选择花生子叶为转化外植体,在芽诱导,分化和诱导生根等培养过程中,确立了 125mg/L 卡那霉素浓度为合适的筛选压,50mg/L 为外植体生根的最低抑制浓度。培养基中Glu的浓度为1mg/L 时可以有效的防止外植体褐化。外植体在OD<,600>为0.2-0.3的农杆菌菌液中侵染1min后共培养4 d,再转移至芽点诱导培养基进行2-3周的丛生芽诱导,接着在芽点筛选培养基中进行筛选,待长出枝条在转移至枝条分化培养基进行进一步的筛选,得到了26个再生株系。 3 通过对转化株的PCR和southern杂交检测,表明目的片段已整合到植物基因组中。得到26株转化株,初步检测结果表明有3株为阳性转化株。 4 通过ELISA检测表明PStVcp cp基因能有效诱导对PStV的抗性。 5 优化和改进了花生遗传转化的技术,如抗生素选择、防止褐化和品种基因型等,并为提高转化效率提出了可行性建议。
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