农田生态系统中长期单一、过量偏施化学肥料特别是化学氮肥，造成农产品品质下降，肥料利用率低，不仅增加了农业生产成本，还严重污染环境，已成为农业可持续发展的一个重要制约因子。上一世纪70年代D（?）bereiner在禾本科植物上发现联合固氮菌，并证实了禾本科植物同样具有生物固氮的潜能。因此，充分发掘和利用禾本科植物的生物固氮潜能，将是确保农业可持续发展的重要途径。 本研究分离、筛选得到一株固氮酶活性高且稳定，生长势强的联合固氮菌株，并对其分类地位、形态及生理特征、对环境的适应性及其对植物的促生效果和作用机理作了系统研究，得结果如下。 固氮菌株的筛选与鉴定：测定从不同来源分离、收集和保藏的12个固氮菌株或分离物在不同保存时期的固氮酶活性和生长能力，发现多数菌株在初分离得到时固氮酶活性较高，但随着转接次数的增多却逐渐丧失固氮酶活性，生长也随之减弱，只有W12在五年前从埃及分离得到至今一直保持旺盛生长势和较高的固氮酶活性，48h内乙烯生成量可达1800nmol乙烯／ml菌液以上，远远高于其它菌株，其生长量(OD₄₀₀值)也远远高于其它菌株。通过比较多个菌株与同一水稻基因型的联合固氮效率及W12与不同基因型的水稻的联合固氮效率，发现供试菌株中W12与水稻的联合固氮效率最高，且远远高于其它菌株；同时这种高的固氮效率在不同的水稻基因型之间没有表现出显著差异。在无氮培养基上该菌在13h后进入对数生长期，并持续至48～52h，这期间其生长代时为2-4h，有氮培养基上为0.9-1h。通过形态观察及生理生化特征测定发现菌株W12为革兰氏阴性菌，短杆状，对数生长期细胞大小为：2.0×1.6μm，单个排列；兼性厌氧，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产酸产气，不运动。结合Biolog系统对其进行鉴定，结果确定该菌为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ss pneumoniae）。属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯氏菌属（Klebsiella）。毒理测定结果表明该菌为无毒非致病菌。 W12菌株对环境因子的适应性研究：无氮培养条件下，测定温度、碳源、酸碱度、渗透压对W12生长及固氮能力的影响，结果表明，在15-40℃下均能生长并表达固氮酶活性，其最适生长及固氮的温度为25-35℃；能利用葡萄糖、蔗糖、苹果酸、甘露醇等多种碳源生长并固氮，当培养基中同时存在蔗糖和苹果酸时，细菌生长和固氮活性最强；在偏酸和偏碱的条件下（pH4.5-8.5）均能保持较强的生长势和较高的固氮酶活性，并能通 过调节自身代谢平衡并适应环境的酸、碱性变化，使培养液趋于中性：能耐受较高的渗 透压，培养液中卜、5％NaCI浓度对其生长和固氮酶活性影响不大，当NaCI浓度升至 2％时，菌株的生长势及固氮酶活性才有所下降：低浓度的铰对其固氮酶活性影响不大， 在0．5．lrnmllL的铰浓度下，分别保持61％和44％的固氮活力。 从我们的实验结果还可得出，在无氮培养条件下，菌株的生长量同其固氮酶活性成 正相关，固氮酶活性越高，W12生长越旺盛。由此可看出，W12对环境因子表现出良 好的适应性。 W12菌株对作物的接种效应：用W12对水稻、玉米、甘蓝上进行接种试验，得到 相似的结果：接种W12后对植物的生长表现出一定的促进作用。以W12菌液蘸秧根接 种玉米后植株的株高、叶绿素含量均比对照植株高，差异达显著水平，地上部干物重也 比对照有所提高；以石英砂和珍珠岩为基质进行水稻水培接种试验，在同一氮水平下， 接种处理水稻的株高，叶绿素含量较不接种处理的对照明显增高，差异达到5％显著水 平，平均单株籽粒数、千粒重、秸杆重和地上部干物重都有一定程度的增加，但差异未 达到5％显著水平；采用随机区组设计在甘蓝上接种也得到一致的结果，接种W12后， 小区平均产量增加 7．8公斤，增产率达 13尸％，从作物的农艺性状来看，接种处理的植 株较对照生长旺盛，枝叶更健壮，色泽更浓绿，特别是根系较为发达。 在玉米上的接种试验我们采用菌液醛秧根、菌液浇根、施用以草碳为载体的固体接 种剂三种接种方法进行，结果发现采用菌液蘸秧根接种表现出显著的促生效果，用菌液 浇施或以草碳为载体的固体菌剂直接施于土表接种，未见显著的接种效应。可见在相同 的供试条件下，接种方法对联合固氮菌的接种效果有着直接的影响。因此，摸索最佳的 接种方法和最优的栽培管理措施仍是今后值得深入研究的主题。 联合固氮菌可通过多种方式促进宿主植物的生长，从我们的实验结果来看，W12 菌液蘸秧根接种玉米后使玉米的茎、叶、鞘、穗各个部位的氮含量及整株氮百分含量均 比对照有明显的提高；接种水稻后水稻根、秸杆和籽粒中钾的含量明显高于对照；接种 甘蓝后，植物的根系较对照粗壮、侧根更发达。说明W12可以通过向宿主植物提供固 氮作用的产物，刺激植物?