甲基对硫磷降解菌的筛选、鉴定及降解酶基因的定位与克隆

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甲基对硫磷(methyl parathion,MP)是目前我国使用量和生产量最大的农药品种之一,虽然该农药的使用对农业的发展有重要的作用,但其高毒性对农产品和环境的安全带来的问题越来越引起人们的重视.利用微生物或微生物源酶制剂来降解农药是近年来的一个主要努力方向.至今,已经陆续分离到许多甲基对硫磷降解菌,但是可矿化甲基对硫磷的菌株却很少.我们从山东高密市受有机磷农药长期污染的土样中分离出多株甲基对硫磷降解菌株,其中之一可能具有彻底降解甲基对硫磷的能力.该菌经形态、生理生化特性分析和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定为变形细菌α-亚群中的根瘤菌科苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.),命名为B2.B2在pH8~9、温度30℃左右生长良好,能以甲基对硫磷为唯一碳源或磷源生长.菌株B2表现对氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素的抗性,但对利富霉素、氯霉素敏感.采用TLC、UV、GC-MS的方法分析了菌株B2降解甲基对硫磷的中间产物,结果表明B2水解甲基对硫磷产生对硝基苯酚(PNP),PNP的进一步代谢通过产生4-硝基邻苯二酚(4-nitrocatechol,4-NC)和1,2,4-三羟基苯(1,2,4-trihydroxybenzene)的途径.采用气相色谱法测定菌株B2对甲基对硫磷的降解率,在起始菌的OD<,600>为0.02时,B2在3hrs内可将100mg/L的甲基对硫磷降解99.2﹪.菌株B2可以以PNP为碳源生长,在48hrs内,将50 mg/L的PNP完全降解;也可以以4-NC为碳源生长,在60hrs内,将30 mg/L 4-NC几乎完全降解.B2含有一个大于23kb的质粒,经吖啶橙结合高温处理的方法进行质粒消除时,获得了缺失质粒的变异株,命名为At.At不含质粒,可以水解MP产生PNP、但不能进一步降解PNP,表明苍白杆菌B2水解MP的基因位于染色体上,而降解PNP的基因与质粒有关.用PCR方法检测发现,菌株B2中的有机磷降解酶基因不是已知的opd基因.通过构建基因组文库,筛选到两个能降解甲基对硫磷的阳性克隆,已经测出的部分序列与mpd基因表现出较高程度的核苷酸序列相似性.
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