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奶牛乳房炎是由多种非特定的病原微生物引起奶牛的常见病,是危害奶牛业的主要疾病之一。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌,约91%以上的病例是由这三种菌引起,其中肠杆菌群性乳房炎发病率高达33.6%,在临床分离的肠杆菌群(coliforms)中大肠杆菌占76.1%。传统的抗生素治疗常常因为耐药性的产生而疗效不佳,同时造成严重的乳中抗生素残留而危害人类健康。因此,近些年来人们开始研究和开发有效的免疫制剂来防制乳房炎。研究表明,外膜蛋白A(OmpA)是普遍存在于革兰氏阴性菌表面的蛋白,在细菌生命活动中发挥至关重要的作用,它可以作为细菌的黏附素和侵袭素,参与生物膜的形成,也可作为多种噬菌体的受体,是先天免疫系统的重要靶位。但有关OmpA的免疫原性和免疫保护作用的研究未见报导。本研究将OmpA蛋白进行原核表达,并制备免疫原免疫接种小鼠,研究其对不同大肠杆菌以及志贺氏菌、克雷伯氏菌攻毒的免疫保护作用,为进一步研究肠杆菌群性奶牛乳房炎基因工程疫苗提供参考。本研究采用PCR方法对大肠杆菌308-2、C83919、O157、J96、2002-1菌株及克雷伯氏菌、志贺氏菌的ompA基因进行扩增和序列分析。然后,构建重组质粒ompA-pET,将其转化至大肠杆菌Rosetta中高效表达,并采用Ni2+树脂纯化表达的融合蛋白OmpA。将纯化的OmpA蛋白与弗氏佐剂等体积乳化后免疫小鼠,每只小鼠每次免疫100μg表达蛋白,并以PBS与佐剂乳化物为对照。初次免疫3周后进行二次免疫,二免后2周用大肠杆菌C83919、O157、J96、2002-1菌株及克雷伯氏菌、志贺氏菌攻毒,观察一周并记录结果。同时,分别在初次免疫的第0,7,14,21,28,35,42,49,56天对各组小鼠采血,用间接ELISA方法对获得血清进行抗体效价检测;分离小鼠脾脏淋巴细胞,通过Elispot的方法检测淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的能力。结果显示,各菌株的ompA基因序列与Genbank核苷酸序列(GeneID: 7437746)的同源性分别为308-2:99.9%;C83919:100%;O157:99.9%;J96:97.7%;2002-1:96.0%;志贺氏菌:94.6%;克雷伯氏菌:86.5%。表达的重组OmpA蛋白以全菌血清为一抗经经Wsetern blot检测可得到清晰且分子量正确的条带。免疫小鼠二次免疫2周后血清OmpA抗体效价可达1:64 000。免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL- 4的斑点形成细胞数(SFC)与对照组相比显著升高(p < 0.05),攻毒1周后,免疫组对不同细菌的免疫保护性都较高。以上结果表明,重组OmpA蛋白可作为疫苗的候选抗原。