巨噬细胞是一群具有高度可塑性的固有免疫细胞,其会随着微环境的不同改变相应的改变功能表型并且也会通过分泌基质金属蛋白酶等参与微环境结构的塑造。Shp2结构上是由两个SH2结构域和一个PTP结构域组成的非受体型酪氨酸磷酸酶。之前的研究表明,其作为关键的信号分子调控病理与生理过程。我们的部分研究表明Shp2在肺泡微环境稳态方面起到非常重要的作用。而作为肺泡微环境中最重要组成部分和最主要的固有免疫细胞,巨噬细胞的活化及其效应分子的表达调控上并不清楚。同时Shp2如何调控巨噬细胞的功能也不是很清楚。因此我们利用条件性巨噬细胞Shp2敲除的基因修饰小鼠模型,离体和体内水平上探究这一调控过程及可能的干预手段。关于巨噬细胞的活化一般意义上被分为两种：经典活化(M1活化)和替代活化(M2活化)。在Thl型细胞因子IFNy/LPS刺激下巨噬细胞呈现M1活化类型；而在Th2型细胞因子IL-4或IL-13刺激下巨噬细胞呈现M2型活化。M2活化的巨噬细胞参与寄生虫感染的防护,损伤修复等病理及病理生理过程,而非正常的M2型活化将正常的生理过程转变为病理过程。因此控制巨噬细胞的M2型活化非常关键,但目前对巨噬细胞M2型活化的机理还不是很清楚,并且其与疾病相关的体内及动物模型方面的研究也不是很透彻。肺泡微环境中由巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶是巨噬细胞参与微环境塑造的最重要的效应分子。有研究表明过度的巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP12)的表达破坏细胞外基质的稳态并造成肺气肿的病理过程。然而,这类基质金属蛋白酶的体内调控研究也还不是很清楚。1.主要研究方法和材料1.1实验小鼠和细胞培养我们将带有LysM-Cre启动子的转基因小鼠与Shp2flox/flox小鼠杂交获取巨噬细胞条件性Shp2缺失的动物模型,用于原代细胞的获取、体内模型及病理模型的评估等。体外研究的细胞系选取RAW264.7巨噬细胞系。通过骨髓诱导得到BMDM (Bone marrow derived macrophage)离体诱导细胞。通过BALF和腹水纯化分别得到肺泡和腹腔原代细胞用于后续研究。1.2体外M2活化的诱导和评估,MMP12的表达及信号转导采用不同浓度梯度及不同时间梯度的IL-4刺激原代及巨噬细胞系。通过实时荧光定量PCR, Western Blotting,激光共聚焦显微镜,化学发光等手段检测M2活化巨噬细胞的标志物或MMP12等的表达,蛋白水平和酶活等。通过对各种信号转导通路蛋白活化的蛋白水平上的评估等探索可能的调控机理。1.3动物模型文中主要采用的动物模型为通过几丁质(Chitin)腹腔注射诱导体内巨噬细胞M2活化的模型,进一步在体内证实Shp2的缺失对巨噬细胞M2活化的影响。通过血吸虫模型评估巨噬细胞体内M2活化和肺纤维化病理表型。通过Bleomycin (BLM)气管给药,诱导肺纤维化的病理模型,评估Shp2调控巨噬细胞活化对纤维化病理过程的影响。通过自然衰老模型,研究衰老相关的渐进性肺气肿表型,评估巨噬细胞Shp2可能造成的基质金属蛋白酶稳态破坏而造成的肺气肿病理过程。2.主要研究结果2.1Shp2作为新的控制巨噬细胞M2活化的重要的负向调控因子；2.2Shp2在IL-4所介导的JAK1/STAT6信号转导中起负向调节作用；2.3Shp2的缺失将促进巨噬细胞M2活化水平进而加速BLM-诱导的肺纤维化病理进程。2.4肺泡巨噬细胞缺失了磷酸酶Shp2会过度表达MMP12；2.5小鼠肺泡巨噬细胞Shp2缺失会自发产生年龄相关的进行性肺气肿；2.6Shp2通过正向调控TGFβ1信号抑制MMP12的过度表达。3.结论Shp2是在巨噬细胞M2活化的新的关键的负向信号调控分子；巨噬细胞中Shp2蛋白水平的下调或缺失将促进M2相关的纤维化病理进程。另一方面Shp2通过正向调控TGF1的信号通路维持肺泡微环境的稳态,肺泡巨噬细胞特异的Shp2缺失将导致衰老相关的肺气肿。