【摘 要】
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背景肝癌是常见的消化系统肿瘤,目前的治疗手段不能很好地改善病人的生存质量及预后。近年来逐渐兴起的CAR-T免疫治疗在肿瘤治疗领域显现出巨大的发展潜力。CAR-T细胞免疫疗法在肝癌治疗方面的应用引起关注。具有靶向性的CAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤能力需待求证。有研究发现,肝癌细胞SMMC-7721可表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ),本研究选择SMMC-7721为靶细胞,观察所构建的特异
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背景肝癌是常见的消化系统肿瘤,目前的治疗手段不能很好地改善病人的生存质量及预后。近年来逐渐兴起的CAR-T免疫治疗在肿瘤治疗领域显现出巨大的发展潜力。CAR-T细胞免疫疗法在肝癌治疗方面的应用引起关注。具有靶向性的CAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤能力需待求证。有研究发现,肝癌细胞SMMC-7721可表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ),本研究选择SMMC-7721为靶细胞,观察所构建的特异性靶向CAR-T细胞对其的杀伤活性,以期为肝癌的CAR-T治疗提供实验基础,为EGFRvIII阳性肿瘤的细胞免疫治疗提供相关实验依据。目的本研究旨在观察靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体修饰T细胞(EGFRvⅢ/2CAR-T)对可表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用。方法1.将第二代EGFRvⅢCAR表达框(EGFRvⅢ/2CAR,1374bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的XbaI和BamHI位点。2.转座子载体(PB-EGFRvⅢ/2CAR)和转座酶双质粒电穿孔(1ⅹ20ms,840V)转导人外周血T细胞,流式细胞术检测EGFRvⅢ/2CAR表达。3.Western blot法检测SMMC-7721中EGFRvⅢ的表达。4.EGFRvⅢ/2CAR-T细胞和SMMC-7721细胞共培养24h后,乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测EGFRvⅢ/2CAR-T特异杀伤活性、ELISA法检测其IFN-γ分泌水平。结果1.重组载体PB-EGFRvⅢ/2CAR经XbaI和BamHI酶切、电泳分析及DNA测序证明基因片段连接无误、核酸序列正确。2.流式细胞术检测结果显示转座子/转座酶双质粒电穿孔外周血T细胞后24小时,EGFRvⅢ/2CAR表达率为55.5%。3.Western blot显示肝癌细胞SMMC-7721在相对分子质量145 000处有EGFRvⅢ蛋白表达。4.效应细胞EGFRvⅢ/2CAR-T和靶细胞SMMC-7721共培养24h后,LDH释放试验证明肿瘤特异性杀伤活性与效靶比呈正比(E:T为1:1、5:1、10:1、15:1、20:1),且肝癌细胞SMMC-7721的死亡率在效靶比5:1至20:1之间,明显高于对照组;ELISA检测到IFN-γ分泌量为(1060.1±89)pg·ml-1,明显高于对照组。(P<0.001)结论靶向EGFRvⅢ的第二代CAR-T细胞能够特异杀伤EGFRvⅢ阳性的肝癌细胞SMMC-7721。
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