本课题针对小流量质谱重复性差的问题,从非酒精性脂肪肝疾病影响因子-成纤维细胞生长因子(FGF-21)这一实际问题出发,采用大流量高分辨质谱实验方法,运用非靶向和靶向定量蛋白质组学技术,结合质谱原始数据处理算法,对血清中FGF-21目标蛋白及肽段进行相对和绝对定量,为非酒精性脂肪肝疾病的临床诊断和生物标志物发现提供了新的实验策略和数据支持。本课题的主要工作如下:(1)色谱重叠峰分离算法的研究。基于色谱峰产生原理,分析色谱重叠峰形成原因,针对色谱峰重叠导致定量分析误差大的问题,提出了一种基于前后向拟合的色谱重叠峰分离方法。为了验证该提出方法的有效性,分别设计了不同重叠程度的色谱峰分离仿真实验和采用气相色谱质谱联用仪实测的对二甲苯和间二甲苯分离实验,并与常规的垂线法、交点垂线法、比例分配法三种方法的计算误差进行对比,结果表明,常规方法最大误差达到了29.92%,前后向拟合方法则可以将误差稳定在1.8%范围以内,具有一定的定量分析优势。(2)谱库预检索算法的研究。针对谱库预检索时间长、检索空间大以及精度低等问题,提出了一种基于质谱分子离子特征峰和碎片离子特征峰的预检索优化算法。该算法主要包括三个阶段:特征峰选择,模糊定位和精确定位。为了评估所提算法的性能,分别以NIST11的主库和复制库作为参考库和查询库,设计了一系列评估实验,同时,还使用实际应用数据验证FPP方法的性能。与两步谱图库预搜索(TSLP)算法和“十峰法”相比,结果表明FPP方法可以获得更高的精度,更小的搜索前空间,更短的时间消耗和更少的剩余谱图。(3)基于大流量质谱的血清目标蛋白相对定量。由于疾病特异性蛋白通常在血液中稀释到低至ng/m L的浓度范围,使其不易被检测出来,采用小流量质谱可以对其进行检测,但其重复性不好。基于这一情况,本文以探究非酒精性脂肪肝影响因子FGF-21在血清中的含量为目的,提出了一种基于大流量质谱的实验策略,以检测其在大流量情况下的检测限。实验结果表明,不同浓度的FGF-21蛋白与其所对应的一级质谱的信号强度成线性关系,因此得到了目标蛋白FGF-21在血清中的最低检测限为400 pg/m L。(4)基于平行反应监测技术的血清目标蛋白绝对定量。为了进一步确定FGF-21蛋白在血清中的检测限,本课题合成了该蛋白的另一条非共享重同位素标记肽段,并将等量的重同位素标记肽段溶液加入血清与不同浓度FGF-21蛋白的混合酶解溶液中,采用基于高分辨高准确度的靶向定量蛋白质组学技术—平行反应监测技术(PRM)进行检测与分析。采用Skyline软件分别对目标肽段的重标与轻标离子色谱峰进行提取,并对其进行积分,根据重同位素标记合成肽段与轻标肽段离子色谱峰的面积,得出相应的FGF-21蛋白轻标肽段的含量,以此确定其最低检测限为400 pg/m L。