论文部分内容阅读
目的:观察快速眼动(Rapid eye movement,REM)睡眠剥夺对小鼠海马组织IL-17、IL-17F m RNA、IL-17炎性蛋白、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)表达及海马齿状回神经祖细胞增殖的影响;进一步探讨REM睡眠剥夺与IL-17/p38MAPK通路及海马齿状回神经祖细胞增殖的相关性及其可能机制,从而为睡眠剥夺后认知功能受损的防治提供理论依据。方法:成年8-10周C57BL/6J小鼠随机分为6组,每组12只:A组(空白对照组):适宜环境下饲养1周;B组(睡眠剥夺3天组):适宜环境下饲养1周,利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天;C组(腹腔注射生理盐水组):适宜环境下饲养1周,腹腔注射生理盐水80ul,3天后处死;D组(腹腔注射外源性IL-17组):正常环境下饲养1周,腹腔注射重组外源性IL-17溶液80ul,3天后处死;E组(睡眠剥夺3天+DMSO):正常环境下饲养1周,利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天后处死,睡眠剥夺前腹腔注射DMSO 50ul;F组(睡眠剥夺3天+SB203580):正常环境下饲养1周,利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天后处死,睡眠剥夺前腹腔注射p38MAPK抑制剂SB203580 50ul。所有实验动物在处死之前保证12h光照(9:00-21:00),12h黑暗(21:00-9:00),并在处死之前2h按100mg/kg腹腔注射Brd U溶液。采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠海马组织IL-17、IL-17F、β-actin基因表达水平;采用Western-blot检测各组小鼠海马组织IL-17、p-p38、β-actin蛋白表达水平;采用免疫荧光双标观察神经祖细胞标记物SOX2与IL-17RA、IL-17RC的共表达情况,采用免疫荧光染色对各组小鼠海马齿状回p-p38阳性细胞数、海马齿状回增殖阳性细胞数进行计数。结果:1、与A组相比,RT-PCR显示B组小鼠海马组织IL-17、IL-17F m RNA表达水平增加,差异具有统计学意义(分别为P<0.001,P=0.012);Western-blot显示B组小鼠IL-17、p-p38蛋白表达增加,差异具有统计学意义(分别P=0.022,P=0.011);免疫荧光染色显示B组小鼠海马齿状回p-p38阳性细胞数增加,Brd U阳性细胞数减少,差异具有统计学意义(分别P=0.046,P<0.001);2、免疫荧光双标发现神经祖细胞标记物SOX2与IL-17RA及IL-17RC共表达;3、与C组相比,D组小鼠海马组织IL-17、IL-17F m RNA表达水平差异无统计学意义(P=0.684,P=0.220),IL-17蛋白水平增加,差异具有统计学意义(P=0.001),p-p38MAPK表达增加,差异具有统计学意义(P=0.010),海马齿状回p-p38阳性细胞数增加,Brd U阳性细胞数减少,差异具有统计学意义(分别P=0.038,P<0.001);4、与E组相比,F组小鼠海马组织IL-17、IL-17F m RNA表达水平、IL-17蛋白表达差异无统计学意义(分别P=0.733,P=0.893,P=0.064),p-p38MAPK蛋白表达减少,差异具有统计学意义(P=0.013),海马齿状回p-p38阳性细胞数减少,差异具有统计学意义(P<0.001),海马齿状回Brd U阳性细胞数增加,差异具有统计学意义(P=0.006)。结论:1、REM睡眠剥夺3天后小鼠海马组织海马齿状回增殖细胞减少,可能是睡眠剥夺后认知功能下降的机制之一。2、REM睡眠剥夺3天后海马组织IL-17基因及蛋白水平增加,海马p-p38MAPK蛋白表达增加,p38MAPK通路处于激活状态;3、海马齿状回神经祖细胞表达IL-17 RA及IL-17RC;4、正常小鼠腹腔注射外源性IL-17后海马p-p38MAPK蛋白表达增加,p38MAPK通路处于激活状态,海马齿状回增殖细胞减少;睡眠剥夺前注射p38MAPK抑制剂SB203580后p38磷酸化通路受抑制,海马齿状回增殖细胞增加;IL-17A与神经祖细胞的IL-17受体即IL-17RA及IL-17RC结合,进而激活p38MAPK信号通路,从而影响海马神经祖细胞增殖;5、REM睡眠剥夺后海马齿状回神经祖细胞增殖受抑制的可能机制为:睡眠剥夺促使海马组织IL-17基因及蛋白水平增加,磷酸化p38蛋白表达增加,过度表达的IL-17与神经祖细胞的IL-17RA及IL-17RC结合,激活p38MAPK通路,可能直接抑制海马齿状回神经祖细胞的增殖,也可能进一步影响周围炎性环境,增强其他促炎因子的作用,从而间接抑制海马齿状回神经祖细胞的增殖。综上所述,IL-17/p38MAPK通路与REM睡眠剥夺后小鼠海马神经祖细胞增殖受抑制关系密切,可能是睡眠剥夺后认知功能受损的机制之一,或参与神经退行性疾病的发生发展,IL-17通过激活p38MAPK通路,直接或间接在睡眠剥夺后海马神经祖细胞增殖受抑制发挥重要作用。