近年来，骨形态发生蛋白(Bonemophorgeneticprotein，BMP)作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视。OP-1又名BMP-7，便是其中备受关注的成员。OP-1是一种骨诱导形成素，在胚胎的骨骼发育和骨修复中发挥作用。体外研究表明，rhOP-1可刺激间充质细胞的增殖及其向成软骨细胞、成骨细胞的分化，并促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶的分泌。由于OP-1具有强烈的骨诱导活性，临床已将其用于治疗骨折、骨不愈合，促进脊椎愈合等，取得显著疗效。此外，OP-1在胚胎时期广泛表达，在成年时主要表达在肾脏，对肾脏发育中具有诱导组织相互作用的潜在功能，是重要的肾脏形态发生蛋白和肾脏内分泌激素。OP-1对动物模型中多种急性肾病具有防御作用，可以改善肾小球和肾间质纤维化，对实验性糖尿病大鼠肾脏的结构和功能具有维持和恢复作用。OP-1对肾病的治疗已经成为新的研究热点。 随着OP-1在临床研究工作的展开，人们需要大量高纯度、有活性的rhOP-1用于疾病治疗。从骨基质中提取的OP-1活性高，但步骤繁琐，产量较低。目前为止已有多种重组BMP蛋白被成功表达。国内也有人利用大肠杆菌、昆虫细胞和CHO细胞表达rhOP-1。但是利用真核表达系统表达的rhOP-1，蛋白质浓度较低，不利于后续的纯化等工作。大肠杆菌可以高效表达rhOP-1，但由于rhOP-1以包涵体的形式表达，需要进行蛋白质的复性，也是该实验要解决的问题。 研究目的： 该实验室已对rhOP-1进行了长期细致深入的研究，获得了大量的经验。在此基础上，该项工作旨在实现rhOP-1成熟肽在大肠杆菌BL21中的高效表达，并进一步摸索rhOP-1包涵体复性的影响因素，确定复性条件，初步探索将层析法用于rhOP-1的复性中，以获得大量有生物活性的rhOP-1，为其工业化生产奠定基础。 研究方法： 将构建好的重组质粒pBV221转化感受态大肠杆菌E.coliBL21,30℃发酵培养。发酵过程中通过调节发酵罐转速和通气量使培养基的溶氧保持在20％以上，利用2mol/LNaOH和1mol/LHCl调节pH值。以葡萄糖为碳源，酵母提取物+蛋白胨作为氮源，补充养料。迅速升温至42℃诱导rhOP-1高效表达，rhOP-1以包涵体的形式存在。利用超声裂解法破裂细菌，经多次洗涤后收集包涵体，用含有6mol/L尿素+30mmol/LDTT的包涵体溶解液溶解目的蛋白。经WesternBlot鉴定是目的蛋白rhOP-1后，利用强阳离子交换介质SPSepharose-FastFolw一步纯化rhOP-1。通过改变pH值、复性时间以及添加多种小分子化合物对rhOP-1复性。初步将阳离子、阴离子交换层析法及尺寸排阻层析法(SEC)用于rhOP-1的复性。以MTT和PNPP法体外测定复性后的rhOP-1促进成纤维细胞的增殖和碱性磷酸酶(ALP)的分泌的生物活性。 研究结果： (1)发酵培养工程菌大肠杆菌BL21时，升温诱导4hr时rhOP-1的表达量最高，占菌体蛋白的33％。放罐时OD600nm值可达9.2，15g菌体/L培养液。WesternBlot鉴定表明，菌体在分子量约为15kD和30kD处各有一条特异性条带，证明所表达的外源蛋白就是目的蛋白rhOP-1。纯化后蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图谱经Totallab分析，rhOP-1的纯度可达98％以上。 (2)透析复性的pH值为6.0，此时可以获得更好的复性效果。复性时透析的时间不宜过长，每隔8hr即可更换透析液降低尿素浓度。L－精氨酸可以有效的抑制复性过程的沉淀的产生，而半胱氨酸/胱氨酸最利于rhOP-1链间二硫键的生成，可使rhOP-1的活性成分二聚体的含量达到31％。其次为GSH/GSSG，rhOP-1二聚体为27％。 (3)层析复性时，蛋白溶液流经层析介质SP-FF和DEAE-FF时，降低尿素浓度均使得rhOP-1沉淀在介质上，且无法用2mol/LNaCl溶液洗脱。对于SEC来说，同样存在沉淀问题，且复性后的单体、二聚体无法分离，具体条件仍需进一步摸索。 结论： 建立了高效表达rhOP-1的工程菌的发酵方法，建立了简便可行的纯化与复性的方法，获得了高表达、高纯度、有活性的rhOP-1。